蜜蜂遺傳育種新技術（一）
——蜜蜂轉基因與克隆

薛運波│文 李志勇│圖

1.蜜蜂轉基因技術

蜜蜂轉基因育種（transgenic breeding）是通過基因工程技術將外源目的基因導入受體細胞，整合到受體細胞基因組中，并使外源基因得到表達和遺傳，以此獲得新品種。該技術的根本意義在于它克服固有的生殖隔離，實現物種間遺傳物質的交換，在改良蜜蜂抗病和經濟性狀以及生物反應器利用等方面展示了良好的應用前景。

自從1982年成功研究出首例轉基因果蠅以來，轉基因昆蟲的研究便引起科學家們極大的興趣。目前，已經獲得成功的轉基因昆蟲有黑腹果蠅、海地果蠅、地中海實蠅、家蠶、蚊子等。鑒于蜜蜂特殊的社會行為和級型分化現象，有學者認為以下兩種方法是蜜蜂轉基因較好的途徑：一是以蜜蜂人工授精技術為基礎的精子介導轉基因法，二是蜜蜂卵或幼蟲的轉基因操作與蜜蜂人工孵育技術相結合的方法。

（1）精子介導轉基因法

1971年，Brackett 等發現精子細胞具有自發地吸收外源DNA，并可在受精的過程中將外源DNA 攜帶進卵內。用精子作為轉移外源DNA 的載體，將DNA 溶液和動物精子共浴，精子能主動吸附外源DNA，利用這一點可以很容易地將外源DNA 導入精子細胞或結合于精子細胞表面。再通過人工授精，將外源DNA 帶入受精卵進而發育成個體（圖1），從而生產轉基因動物。利用精子介導的轉基因蜜蜂的研究也有成功報道。1991年，Atkinson 等首次將蜜蜂精子與外源DNA 進行共培養，證實蜜蜂精子也能夠吸收其他動物的DNA。2000年，Robinson 等研究精子介導轉染法用于蜜蜂轉基因的可行性。結果表明，蜜蜂精子能將外源線性質粒DNA 攜帶進入卵子，外源DNA能在受體蜜蜂個體中存在數月之久，能在幼蟲期進行表達，至少能穩定遺傳三代。盡管沒有找到外源DNA 整合到蜜蜂基因組上的證據，但該研究證明蜜蜂精子同樣具有攜帶外源DNA 進入卵子的能力。基于蜜蜂人工授精技術的精子介導轉基因，操作簡便，成功率高，成本低廉，便于大批量篩選，不但可以用于蜜蜂的分子育種，培育出具有抗殺蟲劑特性、抗病蟲害以及耐寒等蜜蜂品種，而且可以用于蜜蜂基因功能分析及用作生物反應器等研究。

圖1 介導后的卵在實驗室培養出蜜蜂

（2）顯微注射法

借助光學顯微鏡，直接把外源性DNA 注射到蜜蜂卵或者幼蟲體內，獲得轉基因蜜蜂。與其他昆蟲相比，蜜蜂卵的個體和卵黃區均較大，卵殼韌性不易破碎，卵孔明顯，很適合于進行顯微注射操作（圖2）。由于蜂卵產下后1 ～2 小時內卵孔是開啟的，顯微注射操作可以在此時進行，通過卵孔將外源DNA 注入卵內。人為操作勢必會在卵體上留下異味，遭到蜂群的清理，以此，蜜蜂幼蟲的室內人工哺育技術可以作為蜂卵顯微注射后的輔助技術。Milne 等對意蜂卵顯微注射技術做了初步研究，他們在室溫下將1日齡卵固定在玻璃片上，在卵上覆蓋一層低粘度石蠟油，使用顯微操作器向卵注射石蠟后，將其放入35℃保溫箱內孵化，觀察卵的發育。注射石蠟油的卵的孵化率降至21%，孵化時間延長。外源DNA 能否通過顯微注射技術整合到蜜蜂基因組上并有效的表達和遺傳尚不得而知，顯微注射法用于蜜蜂轉基因研究還有很長的路要走。

圖2 轉基因顯微注射設備

2.基因克隆

克隆技術是指從眾多的基因或細胞群體中通過無性繁殖和選擇，獲得目的基因或篩選細胞的技術操作。基因克隆（gene cloning）是上世紀70年代發展起來的一項具有革命性的研究技術，是基因工程的上游工程。美國斯坦福大學的Berg 等人于1972年把一種病毒的DNA 與λ 噬菌體DNA 用同一種限制性內切酶切割后，再用DNA 連接酶把這兩種DNA 分子連接起來，于是產生一種新的重組DNA 分子，從而產生了基因克隆技術。1973年，Cohen 等人把一段外源DNA 片段與質粒DNA 連接起來，構成一個重組質粒，并將該重組質粒轉至大腸桿菌，第一次完整地建立起基因克隆體系。采用重組DNA 技術，將不同來源的DNA 分子在體外進行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子，將這個雜合分子轉移至一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程即是基因克隆。基因克隆過程會涉及到一系列的分子生物學技術（圖3），包括目的DNA 片段的獲得、載體的選擇、工具酶的選用、體外重組、宿主細胞導入和重組子篩選技術等等。基因克隆技術的出現為蜜蜂轉基因育種奠定基礎。

圖3 基因克隆技術檢測設備