豬流行性腹瀉病毒云南省流行毒株S1 基因序列分析

王鑫文，吳靜楠，郭紅瑞，張松梅，鄧成松，魯金強，鄒豐才，張以芳，柴 俊

（1.云南農業大學動物醫學院，云南昆明 650201；2.德宏州尚善品味農業有限公司，云南梁河 679200）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬流行性腹瀉（PED）是養豬業中最常見、危害較嚴重的病毒性腹瀉病，具有高傳染性、高致病性和季節性暴發特征[1]。仔豬由于生理機能尚未發育完善，體內抗體水平低，通常最易感染PEDV[2]。疫苗免疫在PED 防控中起重要作用，但近年來免疫豬只也頻繁發生PED。相關報道和多項研究已證實，PEDV 目前已發生基因突變出現新的變種，并且這種基因突變主要發生在S1基因，這或是造成免疫失敗的原因[3]。

PEDV 為尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬的，單股正鏈有囊膜結構的RNA 病毒，基因組長約28 kb，包括2 個非編碼區和7 個開放閱讀框（ORF）。這7 個開放閱讀框編碼4 個結構蛋白（S、E、M、N）與3 個非結構蛋白（ORF1a、ORF1b 和ORF3）[4-5]。其中，S基因全長4 152 bp，其編碼的S 蛋白是位于病毒粒子表面的纖突蛋白[4]，在PEDV與宿主細胞表面受體結合和入侵宿主細胞過程中起著巨大作用，同時還與介導動物機體產生抗體有著重要聯系，被認為是能夠抵抗PEDV 的主要抗原。根據其他冠狀病毒S 蛋白序列可以將PEDV 人為劃分為S1（1～735 aa，抗原區）和S2（736～1 383 aa，膜融合區）兩個結構域。研究[5-7]表明，S1 結構域易發生變異，能夠更好地適合多種宿主細胞，更能體現病毒變異情況。因此研究S1基因有利于了解、分析毒株特點與變異趨向[5-6]。本研究對2017 年以來采自云南省疑似PED 發病豬只的病料樣品進行PEDV 檢測，然后對檢出的陽性樣品進行S1基因測序分析，以期為PED 防制提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采自云南省12 個地區部分豬場腹瀉仔豬的糞便樣品120份、小腸組織樣品62份，共計182份（表1）。

表1 腹瀉仔豬樣品信息

1.2 主要試劑和儀器

RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DL 2 000 和DL 5 000 DNA Marker，購自寶生物工程有限公司；2×EasyTaqSuper Mix、感受態細胞DH5α、PMD19-T 載體、AMP、IPTG、X-gal，購自北京全式金生物技術有限公司；LB 肉湯、LB 瓊脂，購自廣東環凱微生物科技有限公司。試驗所用儀器，均由云南農業大學動物醫學院實驗室提供。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank 中PEDV 毒株N基因保守區和CV777 株全基因序列（登錄號AF353511），分別設計PEDV 檢測引物（F、R）和S1基因擴增測序引物（SF1/SR1、SF2/SR2），由昆明擎科生物科技有限公司合成。檢測引物序列見表2。

表2 引物序列及擴增長度

1.4 總RNA 提取，目的基因擴增、克隆及基因測序

根據試劑盒說明書提取RNA，配制cDNA 反轉錄體系（20.0 μL）：5×TransScript All-in-One SuperMix For PCR 4.0 μL、RNase-free water 8.0 μL、Total-RNA 8.0 μL。反轉錄程序：42 ℃30 min，85 ℃ 5 s。產物于-20 ℃保存。PCR 檢測反應體系（25.0 μL）：2×EasyTaqSuper Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，F、R 引物各1.0 μL，模板1.0 μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增32 個循環；72 ℃延伸5 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。S1基因前段（SF1/SR1）PCR 擴增反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，54.6 ℃ 30 s，72 ℃ 100 s，34 個循環。后段（SF2/SR2）PCR 反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，擴增34 個循環。DNA 產物用膠回收試劑純化，連接至pMD19-T 載體，轉化至感受態細胞DH5α，提取重組克隆質粒進行PCR 鑒定，并送昆明擎科生物科技有限公司測序。

1.5 S1 基因序列分析

利用DNAstar 軟件對測序獲得的兩段S1基因進行拼接，獲得2 376 bp 序列；利用MEGA7.0 及itol 在線軟件，進行同源性、氨基酸變異位點分析，以及遺傳進化樹構建、修飾和標定。利用DNAstar中的Jameson-Wolf 法進行抗原性變化分析。參考序列與疫苗株信息見表3。

表3 PEDV S1 基因序列參考毒株信息

2 結果與分析

對2017—2022 年云南省12 個地區的182 份腹瀉仔豬樣品進行RT-PCR 檢測，結果在9 個地區的110 份樣品中檢出PEDV 陽性，樣品陽性率為61.20%。選取代表性樣品進行基因測序及拼接，共獲得9 個樣品的S1序列，分別命名為YN-QJ-2017（曲靖）、YN-MZ-2018（蒙自）、YN-XW-2018（宣威）、YN-JS-2019（建水）、YN-DLXG-2020（大理）、YN-LJ-2020（麗江）、YN-BS-202（保山）、YN-CJ-2021（澄江）、YN-XW-2022（宣威）。

2.1 樣品RT-PCR 檢測

樣品RT-PCR 擴增產物的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖1）顯示，在778 bp 左右位置出現清晰的特異性條帶，與預期相符。

2.2 S1 基因擴增純化、克隆及鑒定

對檢測陽性的樣品，用引物S1F/S1R、S2F/S2R，對S1全基因序列分兩段進行RT-PCR 擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果在約1 516、1 187 bp 位置可見清晰的特異性擴增條帶（圖2），與預期目的片段大小一致。對純化的PCR 產物進行克隆、鑒定及測序，得到與預期結果一致的大小約1 516 bp 和1 187 bp（圖3）的目的片段，從而確定重組質粒pMD-19-S1-1 和pMD-19-S1-2構建成功。

2.3 S1 基因核苷酸遺傳進化分析

S1基因遺傳進化分析結果（圖4）顯示，所構建的遺傳進化樹主要分為兩個大分支，即G1 和G2基因群，其中G1基因群包括G1a亞群（經典株）、G1b 亞群（變異株），G2 基因群包括G2a 和G2b亞群。本研究獲得的9 份樣品S1基因可分為1 份G1a 亞群（YN-QJ-2017）、1 份G1b 亞群（YNXW-2022）和7 份G2b 亞群。其中，YN-QJ-2017與國內疫苗株SD-M、CV777-hlj 和P5-V 親緣關系最近，7 份G2b 基因亞群樣品與2011—2018 年的4 株北美洲毒株、1 株韓國毒株、18 株國內流行毒株（包括3 株云南株）和2 株國內疫苗株位于同一個分支，與國內市售G2 基因群疫苗株（AJ1102、L/W/L）親緣關系較遠，而該分支也包含了國內外最近幾年的許多主要流行毒株。

2.4 S1 基因核苷酸及推導氨基酸序列同源性分析

對 9 份陽性樣品與35 株代表性PEDV 參考毒株進行S1基因核苷酸和推導氨基酸序列同源性分析。結果顯示：2 份G1 基因群樣品與7 份G2 基因群樣品的核苷酸和推導氨基酸同源性分別為93.1%～93.6% 和91.1%～91.9%。7 份G2b 基因亞群樣品與CV777、CH-S 及CV777、P5-V、KPEDV-9、83P-5、SD-M 及DR13 等疫苗株的親緣關系很遠，它們間的核苷酸和推導氨基酸同源性分別為91.3%～93.1%和89.4%～92%；與AJ1102和L/W/L 疫苗株以及國內的高致病性變異強毒株CHYJ130330、變異減毒株FL2013、云南流行毒株YNP6 等參考毒株位于不同分支，它們間的核苷酸和推導氨基酸同源性分別為96.1%～98.7%和89.9%～97.9%；而與同一分支的美國變異強毒株USA-Colorador-2013 以及國內的TW-Pingtung-63、CH-hubei-2016、CH-JLDH-2016 等變異流行毒株親緣關系最近，它們間的核苷酸和氨基酸同源性分別為97.5%～99.2%和96.5%～98.6%，說明存在共同祖先，具有密切關系；與3 株云南參考株的核苷酸和推導氨基酸同源性較高，分別為97.6%～98.8%和96.2%～98.2%；與同一分支的國內疫苗株GD-B和XJ-DB2 的核苷酸和推導氨基酸同源性較高，分別為97.0%～97.7%和95.6%～97.6%。

2.5 S1 基因與疫苗株氨基酸突變位點分析

結合系統發育分析結果可知；處于G1 基因群的陽性樣品YN-XW-2022 與同群的疫苗株存在較多一致的突變位點，與G2 基因群疫苗株和陽性樣品在第2、15、361、370、522、554、599、724、729 和771 位發生了一致的突變，分別為R→K、P→S、I→T、E→Q、A→S、T→S、G→S、N→S、N→S、Y→S，此外在第3、42、71、87、152、168、226、306、333 和568 位還發生了與G1 和G2 基因群疫苗株均不一致的突變位點，分別為I→N、Q→H、I→L、S→A、K→R、I→L、G→S、D→G、A→V、K→N；處于G2 基因群的7 份陽性樣品與AJ1102、XJ-DB24等4 株疫苗株在第13、139、289 和363 位發生了不一致的突變位點，分別為V→L、N→D、I→M、A→T。這提示，現有的G2 基因群疫苗株對現有流行毒株不能提供完全保護甚至發生免疫失敗現象。

2.6 S1 蛋白抗原位點變化分析

S1 蛋白主要抗原中和位點存在于COE 和SS2 區域。陽性樣品與疫苗株（CV777、LW/L、AJ1102）的S1 抗原位點分析結果（圖6）顯示：處于G1 分支的2 份樣品與同源經典疫苗株CV777相比抗原性差異較小，但YN-QJ-2017 株S1 蛋白主要抗原中和表位COE 區域在第605～613 位明顯增加，第540～548 位明顯減少。處于G2 分支的疫苗株與陽性樣品YN-MZ-2018、YN-JS-2019、YNDLXG-2020 和YN-CJ-2021 在第240～254 位明顯減少，與YN-XW-2018 在第320～326 位明顯減少，與YN-JS-2019 在第389～404 位明顯減少；在COE區域，YN-CJ-2021 的第502～510 位，YN-LJ-2020的 第529～537、605～613 位，YN-JS-2019 的第540～548 位明顯減少。這可能導致云南省流行毒株與疫苗株在抗原性上存在差異。

3 討論

2010 年以來，PED 的暴發流行給我國養豬業造成了巨大經濟損失。Zuo 等[15]對2012—2017年從云南省采集的435 份豬腹瀉樣品檢測發現，PEDV 樣品陽性率逐年上升。本研究從2017—2022年陽性樣品中擴增得到9 份樣品PEDVS1基因，且樣品來源豬群均已接種CV777、AJ1102 和L/W/L 株疫苗，說明這些疫苗株未能對PEDV 流行提供很好的預防。通過S1基因遺產進化和同源性分析得知，9 份PEDV 陽性樣品位于G1 基因群和G2b基因亞群。這兩種基因型毒株也導致了美國和韓國PED 疫情暴發。李曉成等[8]分析2017 年我國豬群腹瀉疫病流行狀況，發現PEDV 為主要病原，其中G2 基因群占90%，說明G2 基因群是我國的優勢流行株；楊漢春等[9]對我國部分省份進行PEDVS1基因檢測也得出相同的結論。可以看出，云南省和國內其他地區當前的PEDV 流行株基本一致。從疫苗株的S1 蛋白氨基酸突變位點分析來看，2份G1 基因群樣品和7 份G2 基因群樣品與各自同群的疫苗株均存在較多相同的突變位點，但也存在不一致的突變位點。值得注意的是，G1 基因群樣品YN-XW-2022 與G2 基因群樣品和疫苗株在第1～163 位存在10 處一致的突變位點，同時也存在9 處與G1 和G2 基因群毒株都不一致的突變位點。這提示PEDV 流行毒株在疫苗免疫和繁育過程中可能發生了G1 和G2 基因群的基因重組或變異現象。Cuo 等[10]對PEDV 流行毒株進行遺傳進化和基因型分析，發現存在G1 和G2 基因群重組毒株。王若木等[11]研究G2 基因型PEDV 疫苗免疫后的毒株遺傳進化特點發現，廣西地區PEDV 毒株在免疫壓力下S1 蛋白氨基酸序列發生了獨特的突變。從這方面看，流行毒株S1 蛋白的這一系列變化可能會導致云南省PED 免疫失敗。

PEDV S 蛋白與細胞表面受體結合、入侵宿主細胞以及介導動物機體產生抗體有著重要聯系，是研發疫苗的首要目的蛋白；不同毒株S基因間存在不同程度的核苷酸插入、缺失和突變等現象，進而影響其抗原性[12-13]。Chen 等[14]通過PEDV 變異株基因序列分析，首次公布了PEDV 變異株的主要變異區為S1基因。朱海俠等[12]通過分析4 株分離株與疫苗株PEDVS1基因主要抗原表位區抗原位點變化，推測抗原表位變化可能是影響PEDV 感染的主要原因。因此，通過PEDVS1基因主要抗原表位區的位點變化，結合遺傳進化和同源性分析，比較分離株與疫苗株S1基因的差異，可推測現有疫苗的保護情況。本研究發現，陽性樣品與不同基因群的3 株疫苗株相比，在S1 蛋白主要抗原中和表位區COE 區域和以外區域均出現了不同程度變化，提示現有疫苗對云南省PEDV 流行毒株不具有較好的免疫效果，迫切需要研發能保護豬只免受新型PEDV 攻擊，并且安全、有效以及低價的疫苗[15-16]。

4 結論

綜上所述，云南省部分地區同時流行G1 基因群和G2b 基因亞群兩種PEDV 基因型毒株，但G2b 為優勢流行基因亞型，其與同群的北美洲毒株有密切親緣關系；云南流行株和疫苗株間存在較遠的遺傳親緣關系，已發生了部分氨基酸突變，尤其在抗原表位區，推測現有疫苗株對云南省部分PEDV 流行毒株不具有較好的保護效果，這很可能是導致現在PED 控制不理想的原因。