非洲豬瘟病毒基因分型與血清分群研究進展

戈勝強，左媛媛，韓乃君，呂 艷，屈海龍，路皓東，吳曉東，王志亮

（1.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；2.山東農業大學，山東泰安 271018）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）基因組為線狀雙鏈DNA，整個基因組長度為170～193 kb，包括左側可變區（left variable regions，LVR）38～48 kb，中央保守區（central conserved region，C 區）約125 kb 和右側可變區（rightvariableregion，RVR）13～22 kb。不同毒株的基因組序列可能會在LVR 內的多基因家族（mltigene family，MGF）、C 區內的中央可變區（central variable region，CVR）和EP402R基因（表達CD2v 蛋白）等位置存在顯著差異。這些可變區為ASFV 的進化分析特別是遺傳演變研究提供了有力條件。但是我國針對該領域還無專業闡述，沒有全面展示ASFV 基因分型和血清分群的研究進展，為此就相關研究進展進行綜述，以期為我國ASFV診斷技術及遺傳演變研究提供參考。

1 基因分型研究

在非洲豬瘟（African swine fever，ASF）早期研究中，科研工作者借助紅細胞吸附試驗（hemadsorption reaction）[1-2]、瓊脂擴散沉淀試驗（agar diffusion precipitin test）[3]、補體結合試驗（complement-fixation test）[4]和等電沉淀技術（isoelectric precipitation）[5]等諸多技術，逐漸認識到ASFV 存在抗原多樣性。隨后，利用限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析，將ASFV 分為I、II、III 和IV 共4 個主要群（1984 年）[6]或I—V共5 個組（1989 年）[7]，并提出以此方法進行病毒分型應以基因組的中間位置為目標區域。另有報道[8]利用RFLP 對軟蜱中分離的ASFV 進行了分型研究；但是RFLP 技術無法快速進行病毒來源追溯，使得利用該技術進行ASFV 分型的研究停滯不前[9]。伴隨著基因克隆技術、PCR 技術和測序技術的快速發展，ASFV 的基因組研究也在不斷深入。繼1984 年首次成功構建含有98%基因組信息的文庫[10]之后，ASFV基因組文庫構建的研究逐漸增多，這為后期的基因測序及分析打下了基礎。

1.1 P72（B646L）基因分型

1990 年，Lopez-Otin 等[11]對P72 蛋白編碼基因全長進行了測序分析，為研究P72 蛋白編碼基因作為診斷基因奠定了基礎（P 為結構蛋白英文縮寫，72 指蛋白相對分子質量103的數字部分[12]）。1992 年，Steiger 等[13]首次利用PCR 技術建立了ASF 快速診斷技術。1996 年，Yu 等[14]對4 株分離自不同地區的ASFVP72基因核酸及編碼蛋白序列進行比對，發現P72基因序列高度一致（97.8%～100%），該結果與之前研究[15-16]發表的P72 蛋白抗原穩定的結論相符，由此進一步奠定了P72基因作為抗原分型理想基因的重要地位。

2001 年，Gonzague 等[17]利用P72基因部分片段證明了1999 年分離的ASFV 馬達加斯加毒株與1994 年分離的莫桑比克毒株序列最接近。2003年，Bastos 等[9]利用P72 蛋白C 端末端（位置為498～635）序列，首次將ASFV 劃分為10 個基因型。通過與RFLP 方法比較，該研究證實在P72基因序列水平上，不同ASFV 毒株之間的遺傳變異率可達9.4%，說明該方法適宜進行分子流行病學分析且可以更好地區分暴發時間和地理分布相近的非洲東部或南部毒株。2005 年，Lubisi 等[18]進一步將ASFV 劃分為16 個基因型，并首次從東非境內的森林循環宿主（軟蜱或野豬）中發現基因I 型毒株。2007 年，Boshoff 等[19]對南非1973—1999 年分離的43 株ASFV 進行比對分析，發現了6 個新分支。至此，ASFV 被劃分為22 個基因型。

此后，ASFV 的進化分析主要以此為基礎，利用P72基因進行ASFV 基因分型的研究逐漸增多并成為最重要的分型標準。2016 年，Achenbach等[20]對2011—2014 年埃塞俄比亞分離的ASFV 進行P72基因進化分析，發現了第23 個基因型。該基因型與流行于非洲東部國家和剛果民主共和國的IX 和X 基因型來源于同一個進化分支。2017 年，Quembo 等[21]在莫桑比克戈龍戈薩國家森林公園采集的軟蜱樣品中分離到19 株ASFV，經進化樹分析發現，其中5 株病毒屬于新的進化分支，因此被命名為第24 個基因型。基于P72基因分型已被廣泛使用，所以通常所說的ASFV 基因型就是指P72基因分型。

1.2 IGR 分型

雖然P72基因分型的方法得到大多數研究者認可，但這種分型對于家豬相關分支（如基因I 型分支，又稱ESACWA 分支）內毒株相互之間的區分度太低，因此導致P72基因分型方法較少用于追蹤同一區域內疫情暴發的源頭和過程[9，22]。為進一步查找同一地域內相近毒株的進化演變趨勢，2014 年Gallardo 等[23]對ASFV 全基因序列進行了深度分析，發現不同地域/時間流行的ASFV 在I73R和I329L基因的中間區域（intergenic region，IGR）存在不同數量組合的串聯重復序列（tandem repeat sequences，TRS），如波蘭和立陶宛ASFV分離株的IGR 與白俄羅斯和烏克蘭分離株相同（有10 bp 的重復序列插入，后命名為IGR-II 型），而與俄羅斯分離株不同（無10 bp 的重復序列插入，后命名為IGR-I 型），提示波蘭和立陶宛ASFV 流行株可能來自白俄羅斯。但進一步研究[24]發現，俄羅斯境內的ASFV 分離株從2012 年開始在IGR位置出現變化，提示傳入歐盟的ASFV 毒株可能來源于俄羅斯。該毒株于2012 年或更早的時期出現，經由白俄羅斯和烏克蘭傳入歐盟。2015 年以后，在波蘭檢測到IGR-I 型毒株，在俄羅斯西部檢測到IGR-II 型毒株，表明歐洲地區的病毒流行更加復雜，也說明IGR 分型可以對ASFV 的分子流行情況提供更精確的分析，并在很多研究中成為與P72基因分型和CD2v 血清學分型同等重要的分析指標，如在中國[25-27]、比利時[28]、印度[29]、韓國[30]、馬來西亞[31]、印度尼西亞[32]、越南[33]、俄羅斯[34]、意大利[35]等首發/重要疫情確診毒株或長時間流行毒株演變分析中，均使用IGR 分型進行進化溯源分析。

2018 年8 月，ASFV 傳入我國后，我國科學家對引發每次疫情的分離株都進行IGR 分型分析。目前國內主要的流行毒株屬于IGR-II 型。但2018 年11 月國內分離的第一個野豬疫情毒株（China/Jilin/2018/boar，MK189457）屬 于IGR-I型，與當時家豬流行毒株不同，因此推測此次疫情不是由周邊家豬傳入[27]。2019 年3 月，國內首次發現IGR 位置出現2 個串聯重復序列（20 bp）插入的毒株（China/Guangxi/2019/domestic pig，MK670729），這是世界范圍內首次發現，并因此將其命名為IGR-III 型毒株[26]。相似的，IGR I—III 型毒株在韓國[36]和越南[37]也有報道。較詳細的數據顯示，越南對2019—2021 年分離的122 株ASFV 進行了IGR 分型研究，發現IGR II 型毒株占95.9%（117/122），IGR III 型占3.3%（4/122），IGR I 型只分離到1 株[37]。2019 年，波蘭發現了3個串聯重復序列（30 bp）插入的毒株（Poland，Warminsko-Mazurskie 2019），并將其命名為IGRIV 型毒株[38]。IGR 分型的不斷增加，預示著ASFV 在長時間流行過程中，伴隨著在豬體內的不斷復制傳播，可能會在某些位置（如IGR 位置）出現序列變化。

1.3 9RL/B602L 基因分型

1990 年，Dixon 等[39]利用RFLP 技術，對17 株馬拉維共和國分離株進行序列分析，發現在ASFV 基因組中部125 kb 的保守區域內含有1 個CVR。1996 年，Irusta 等[40]進一步對CVR 研究發現，該可變區是因9RL基因中四聚體重復區存在序列差異導致的，且在不同毒株以及細胞適應株與種毒之間變異性較高。Irusta 等[40]發現CVR 的片段大小為228～300 bp，Phologane 等[22]發現CVR 片段大小為360～686 bp，而Boshoff 等[19]發現CVR 片段大小為377～533 bp。2020 年，Vilem 等[41]又進一步將基因II 型分離株劃分為GII-CVR1 和GIICVR2。不同毒株之間CVR 序列信息和片段大小都有差別[22，42-43]，這種多變性使得CVR 不適合進行基因型劃分[19，42]，但在探討國家[42]、地區[19]層面以及基因型間[43]流行復雜性上可以發揮作用[44]。目前利用B602L基因進行ASFV 分析常與P72基因相結合，首先以P72基因進行基因分型，然后利用CVR 進行差異分析，以進一步明確相同P72基因型內各個毒株的關系。

1.4 P54（E183L）基因分型

雖然早在1995 年，Sun 等[45]就已證實P54基因在不同細胞傳代株之間可以發生變異，但基于P54基因進行進化樹分析的卻不是很多。2008 年，Rowlands 等[46]分析了2007 年傳入格魯吉亞的ASFV，發現其P54基因序列與5 株馬達加斯加分離株和2 株莫桑比克分離株完全一致，與之后分離的2 株莫桑比克分離株在多個位點有差異，此結果對研究格魯吉亞毒株的來源發揮了重要作用。2009年，Gallardo 等[47]同時利用P54、P72和B602L基因對肯尼亞2006—2007 年流行的ASFV 分離株進行了進化樹分析，結果發現P54與P72的基因進化樹基本一致，但在P72基因型最大分支基因I型中，P54基因型可進一步劃分為4 個分支，分別被命名為Ia、Ib、Ic 和Id。Ia 型主要來自歐洲和美洲，Ib 型來自西非國家，包括Lisbon57 毒株，而Lisbon60 和Mzuki 毒株則分別被劃分為Ic 和Id 型。另有研究[48]對贊比亞2005 年分離株的P54基因進化分析，結果發現該毒株屬于P54基因型 Id 分支，提示引起此次疫情暴發的毒株可能來自贊比亞國內或南非區域。但進一步研究[49-50]顯示，贊比亞分離株的P54基因分型還曾包含有Ie、If、Ig、IIa、IIb、VIIIa、VIIIb、XI、XIII 和XIV，提示贊比亞流行株包含了多個進化分支。目前，P54基因分型只作為輔助分析指標使用，可能原因是P54基因分型相比P72基因分型，差異不顯著，且相比CVR 分析，區分度不顯著。

1.5 其他基因分型

除常利用P72基因、IGR 位置、9RL/B602L基因和P54基因進行基因分型外，為更好地探討毒株之間的進化差異，特別是同一個區域內毒株的進化趨勢，研究者還對P30（CP204L）[35，46，50]、CD2v（EP402R）[35]、TK（thymidine kinase）[51]以 及J268L[43]、Bt/Sj[43]、KP86R[43]、O174L[52]、C315R/C147L[53]、K145R[38]和MGF 505-5R等基因[38]進行比對分析。Nix 等[43]對J268L、Bt/Sj和KP86R基因進行序列分析，結果發現不同分離株的基因長度和序列有部分差異，可以用于區分進化相近的分離株。Sanna 等[35]利用P30（CP204L）基因、IGR 位置和EP402R基因對意大利撒丁島流行多年的ASFV 進行了基因分析，結果發現P30基因和IGR 位置高度穩定，而EP402R基因卻可以將毒株劃分為2 個分支——第一個分支為1978—1990 年流行毒株，第二個分支為1990—2014 年流行毒株，這提示ASFV 流行株可能在不斷提升的疫病控制和診斷技術水平下，受到選擇壓力的影響發生部分變異。2017 年，Onzere 等[51]首次利用TK基因對ASFV 流行株進行分析，結果發現2011—2013 年的肯尼亞分離株與南非參考毒株有明顯差異。2019 年，Mazur-Panasiuk 等[54]通過全基因測序在波蘭分離株中發現K145R和MGF 505-5R等基因中出現單個核酸序列改變導致的蛋白序列改變（single nucleotide polymorphism，SNP）。隨后，通過對O174L基因、K145R基因和IGR 位置進行同時測序和組合比對，將波蘭毒株分為4 個遺傳進化群[38]。這些研究提示，將上述“分子指紋”（molecular fingerprints）基因進行組合分析，可更深入地了解同一區域內毒株的流行演變規律。

2 血清分群研究

1963 年，通過紅細胞吸附抑制（hemadsorption inhibition，HAI/HADI）試驗和感染豬交叉保護試驗，科學家首次用試驗數據證實ASFV 存在抗原差異[2]。隨后對多株ASFV 進行的HAI 顯示，ASFV之間的抗原差異可將ASFV 進行分類或分型[1，55]，并將具有血凝性的ASFV 分為A、B 和C 共3 個亞型[56]。但這種分型方式沒有繼續使用下去，可能原因是HAI 試驗需要活病毒和恢復期血清，而ASFV 的高致死率無法持續獲得血清轉化的存活家豬[6]，且針對HAI 的抗體產生時間較晚，滴度較低[57]。因此，探索HAI 血清分群機理，查找HAI血清分群抗原決定簇顯得尤為必要。經過眾多研究者的不斷努力[58-63]，最終證實CD2v（EP402R）和EP153R（C-type lectin）基因與ASFV 的HAI緊密相關，且該區域為ASFV 基因組序列中變異較大的區間[64]。隨后，俄羅斯VNIIVViM 研究所進行了更深入長久的研究，并最終基于CD2v 和C-type lectin 蛋白編碼基因的特定區域序列比對，將ASFV 劃分為至少8 個血清群[57]。經與P72基因分型比較，Malogolovkin 等[65]發現：P72基因分型與基于CD2v 和C-type lectin 的血清分群在相對有限區域內（如南非地區的分離株）差異較大；相反，在一些只有單一基因型疫情暴發的非疫源地國家，分離毒株的基因分型和血清分群無顯著差異；同時，同一個基因型內也可能包括多個血清群，如血清I 型、II 型、IV 型都可被劃分到基因I 型中，說明歐洲大陸分離的ASFV 毒株有多種來源背景。以上結果進一步說明，在某些情況下，標準的P72基因分型可能無法有效區分相似來源背景的ASFV毒株。

3 結語

ASFV 基因分型與血清分群都是基于特定的基因序列比對分析所得，目前通過常規PCR 擴增和核苷酸測序比對分析可以很快確定ASFV 基因分型與血清分群。ASFV 基因組較大，所以ASFV 在不同細胞系、宿主體內（特別是在野豬和軟蜱）復制傳代時，容易造成基因組末端可變區和中央可變區發生序列插入和缺失。而P72基因相對保守，所以當只有一個毒株在一定區域內流行時，一般不會發生基因型變化，因此P72基因分型是國際最通用、快速、方便的分型方法，并且仍是病毒新傳入某區域后進行鑒別診斷的首選方法。其他基因分型及血清群分析，因這些基因變異性相對更強，故可有助于分析ASFV 分子流行病學變化和預判毒力演變。研究ASFV 基因分型可以有助于從分子水平追溯引發疫情的病毒來源，掌握潛在的傳播途徑及可能的傳播方式。

目前非洲流行的ASFV 包含所有的24 個基因型，且主要分布在東非和南非。中非主要流行基因I 型和II 型，西非部分國家主要流行基因I 型，而北非尚無疫情報道[66]。20 世紀60 年代在西歐國家流行的毒株主要是基因I 型，2007 年傳入格魯吉亞并擴散到俄羅斯、東歐諸國的毒株是基因II 型、血清8 群。我國ASFV 流行株和亞洲流行株也是基因II 型、血清8 群。因此，研究ASFV 基因分型和血清分型有助于從分子水平追溯引發疫情的病毒來源，掌握潛在的傳播途徑及可能的傳播方式，對于該病的流行病學分析具有重要意義。