2021 年云南省邊境地區?？谔阋哐鍖W調查

寇美玲，謝佳芮，廖德芳，宋建領，苗海生

（云南省畜牧獸醫科學院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224）

口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）引起的，主要感染豬、牛、羊和其他偶蹄類動物的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1-2]。該病分布廣，傳播速度快，傳播途徑多，流行周期長，不易防控和根除，因而被世界動物衛生組織（WOAH）列為須通報動物疫病，被我國列為一類動物疫病[3-4]。FMD 曾在世界范圍內多次暴發流行，在新流行地區，引起的牛發病率可達90%～100%，對成年牛的致死率為3%～5%，而對犢牛的致死率高達70%～80%[5]，也可導致感染動物生產性能下降，種用價值喪失，給畜牧業帶來巨大經濟損失[6]。近年來我國FMD 防控取得了較大進展，但零星疫情依然存在[7]。FMDV 共7 個血清型，其中在亞洲主要流行O、A 和亞洲I 型[3]，在我國近年來主要是O、A 型。疫苗免疫是預防和控制 FMD的主要方式。我國目前對 FMD 實行強制免疫策略，采取“先打后補”的補助方式。FMDV 抗體水平是評價疫苗免疫效果的主要方式。為掌握云南省邊境地區FMDV 的疫苗免疫效果和感染情況，2021年在邊境地區7個縣（市）采集牛血清樣品1 522份，采用cELISA 方法進行FMDV O 型、A 型和非結構蛋白抗體檢測，評價疫苗免疫效果及帶毒風險，從而為該病防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

2021 年采集云南省邊境地區景洪市、芒市、孟連縣、勐?？h、勐臘縣、滄源縣和盈江縣等7 個縣（市）的1 522 份牛血清樣品。每個縣（市）按采樣點所屬地理位置劃定區域，將區域內養殖場、隔離場和散養戶編號，隨機抽取養殖場1～3 個、隔離場1 個、散養戶3～19 個，場群內按牛耳標號隨機采樣。樣品采集由7 個縣（市）動物疫病預防控制中心實施。具體采樣信息見表1。

表1 云南省邊境地區7 個縣（市）采樣信息統計

1.2 主要試劑

O、A 型FMDV 標準陰、陽性血清，O、A 型FMDV cELISA 抗體檢測試劑盒，參照Mackay 等[8]、Paiba 等[9]方法，由云南省畜牧獸醫科學院國家口蹄疫專業實驗室（昆明）制備[101]；試劑盒涉及的FMDV A、O 型滅活抗原，由中普生物有限公司（保山）提供；FMDV 非結構蛋白單抗阻斷ELISA 試劑盒，購自深圳真瑞生物技術有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 血清抗體檢測 利用O、A 型 FMDV cELISA 抗體檢測試劑盒，對樣品進行血清學檢測，兩種血清型操作方法相同。取出試劑盒提供的ELISA 板，加入10 μL 待檢血清以及陽性、陰性對照血清至相應檢測孔和對照孔，每孔加入50 μL 100倍稀釋的競爭抗體，震蕩混勻，37 ℃溫育1 h；PBST 洗板3 次，吸水紙上拍干；每孔加入50 μL 1 000 倍稀釋的兔抗豚鼠HPR 酶標二抗，37 ℃溫育40 min；洗板5～6 次拍干；加入TMB 顯色液100 μL/孔，37 ℃避光溫育10 min；加入終止液100 μL/孔，ELISA 讀板儀450 nm 波長測定樣本和對照的吸光值A450。試劑盒質控標準：陽性對照孔平均A450值≥0.8，陰性對照孔平均A450值≤0.3 時，試驗結果成立；抑制率≥40%時判定為陽性，＜40%時判定為陰性。

1.3.2 非結構蛋白抗體檢測 利用FMDV 非結構蛋白單抗阻斷ELISA 試劑盒，按照試劑盒說明書操作。結果判定：阻斷率=（陰性對照A450平均值-樣品孔A450平均值）/陰性對照A450平均值×100%。當陽性對照A450平均值≥55%，且陰性對照A450平均值-陽性對照A450平均值≥0.6 時，試驗結果成立；被檢樣品阻斷率≥40%判定為陽性，25%～40%判定為可疑，＜25%判定為陰性。

1.4 數據分析

比較FMDV O 型、A 型及非結構蛋白抗體陽性率，采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 地區分布

地區統計結果（表2）顯示：2021 年云南省7 個邊境縣（市）1 522 頭份牛血清樣品FMDV O 型抗體陽性率為40.10%～85.50%，A 型為58.50%～84.50%，非結構蛋白抗體為25.76%～57.50%，O 型（57.61%）、A 型（67.29%）平均抗體陽性率均未達到國家最低要求（≥70%）。各縣（市）抗體陽性率有所差異，其中勐臘縣最高（O型85.50%、A 型84.50%、非結構蛋白57.50%），不同地區間O 型、A 型及非結構蛋白抗體陽性率均差異顯著（P＜0.05）。勐臘、盈江牛非結構蛋白抗體陽性率分別達57.50%、54.62%，說明這些地區存在FMD 流行的可能性較大。

表2 云南省邊境不同地區牛FMDV 抗體檢測結果統計

2.2 群間分布

2.2.1 不同來源 不同來源牛統計結果（表3）顯示：1 522 份牛血清樣品中包含入境牛樣品340份、本地牛1 182 份；本地牛O、A 型抗體陽性率分別為54.31%、63.87%，非結構蛋白抗體陽性率為40.52%，入境牛O、A 型抗體陽性率分別為70.29%、79.70%，非結構蛋白抗體陽性率為58.23%。入境牛O 型、A 型、非結構蛋白抗體陽性率均明顯高于本地牛（P＜0.05），說明入境牛免疫抗體水平較低，帶毒風險較大。

表3 不同來源牛FMDV 抗體檢測結果統計

2.2.2 不同飼養方式 不同飼養管理方式牛的FMDV 抗體檢測統計結果（表4）顯示：規模場牛O、A 型FMDV 抗體陽性率總體高于散養戶，非結構蛋白抗體略低于散養戶，說明規模化養殖場疫苗免疫狀況好于散養戶，帶毒風險低于散養戶；而隔離場均為外來牛，3 項檢測指標均明顯高于國內規模場和散養戶（P＜0.05）。

表4 不同飼養管理方式牛的FMDV 抗體檢測結果統計

3 討論

云南省地處我國西南邊境，邊境線漫長且犬牙交錯，邊民往來頻繁，活牛走私入境活動難以控制[11-12]。2020 年以來，受新冠肺炎疫情影響，邊境管控加強，入境牛數量雖大幅減少，但依然存在。東南亞地區是FMDV 疫源地。據WOAH 官方網站公布的信息統計，2020 年1 月—2021 年6 月東南亞地區共發生500 余起FMD 疫情，這對我國FMD 防控形成較大威脅。云南省邊境地區作為阻斷東南亞 FMD 疫情傳入我國的第一道屏障，疫苗免疫強度和效果尤為重要。本次調查對同1 份樣品分別進行O、A 型FMDV 抗體檢測和非結構蛋白抗體檢測，前者是為了評價免疫效果，后者是為了判斷感染情況，檢測結果具備一定的科學性和全面性。

血清樣品采集自云南省邊境地區7 個縣（市）。這些地區牛養殖相對集中，并且是外來牛入境重要通道，因此所采樣品具有一定代表性。O、A 型FMDV 抗體檢測結果顯示，云南省邊境地區抗體水平偏低，除勐臘縣外，其他縣（市）均未達到70%的國家最低免疫要求，亟需提升疫苗免疫強度。非結構蛋白抗體檢測結果顯示，云南省邊境地區牛非結構蛋白抗體陽性率整體偏高（25.76%～57.50%），說明邊境地區存在一定的FMDV 流行風險，但也可能與接種的疫苗未經純化以及該檢測方法本身的缺陷有一定關系。勐臘和盈江縣的非結構蛋白抗體陽性率分別達到57.5%和54.62%，經查證這兩個地區的牛多數為走私入境牛。不同飼養方式牛的統計結果表明，隔離場中邊境緝私部門查獲的走私入境牛O、A 型抗體和非結構蛋白抗體陽性率均高于本地牛。考慮到緬甸、老撾等東南亞國家FMD 疫情現況和免疫情況，推斷這部分牛可能感染過或攜帶有FMDV。同時還發現，規模場疫苗免疫狀況好于散養戶，非結構蛋白抗體陽性率低于散養戶，表明規模場抵御FMDV感染的能力要強于散養戶。

4 結論

云南省邊境地區牛FMD 免疫保護水平不高，且存在一定的病毒傳入風險，亟需進一步提高疫苗免疫接種強度和免疫效果評估力度，持續對云南省邊境地區開展牛FMD 病原學和血清學監測，掌握其流行病學特點和規律，以便及時發現和預警FMD 疫情，為邊境地區FMD 防控提供數據支撐。