葡萄中花青素含量的測定與分析

◎ 李 夏

（玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，廣西 玉林 537000）

花青素（Anthocyanidin）也稱為花色素，是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，能為人體健康帶來諸多裨益。花色素有較強(qiáng)的抗氧化能力，能很好地清除氧自由基，從而有效抑制細(xì)胞凋亡。其原理是在天然的環(huán)境下，花青素常與各類單糖進(jìn)行結(jié)合，從而形成花色苷，達(dá)到較好的抗氧化效果[1]。花青素對人體健康有著諸多功效，能起到抗疲勞、調(diào)節(jié)血糖等作用，同時(shí)對心腦血管疾病的預(yù)防也有著重要的作用。正是由于花青素的諸多作用，其在食品、醫(yī)美、保健等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[2]。為了能更好地將花青素應(yīng)用在食品領(lǐng)域，需研究出合理且高效的定性、定量方法。

葡萄的花青素主要貯存在葡萄籽和葡萄皮中，相對于葡萄皮來說，葡萄籽更易提取和分離花青素。提取花青素的常用方法有微波輔助提取法、超聲輔助提取法、超臨界提取法、溶劑萃取法和索氏提取法等，這些方法根據(jù)其作用也各有特點(diǎn)。現(xiàn)階段，對花青素的檢測方法也較多，主要的檢測方法為高效液相色譜法和分光光度法。本文結(jié)合實(shí)際情況采用超聲輔助提取法進(jìn)行花青素提取，同時(shí)結(jié)合分光光度法進(jìn)行檢測，從而得到花青素的含量[3]。本文將矢車菊素-3-葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)對照品進(jìn)行花青素含量的測定，同時(shí)由于其具備自顯色能力，無需額外添加顯色劑，這也是本實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)勢之一。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨峰葡萄，購自當(dāng)?shù)爻校皇杠嚲账?3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，上海廣銳生物科技有限公司；二級純水，實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)自制；無水乙醇、鹽酸、氯化鉀、乙酸鈉、乙酸和檸檬酸鈉，分析純，上海國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004 萬分之一電子天平、DHS-16A 水分測定儀，上海力辰邦西儀器科技有限公司；KQ3200E 超聲清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；N4S 紫外-可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

將新鮮的巨峰葡萄去除表皮和果肉并洗凈得到葡萄籽，將葡萄籽進(jìn)行初步破碎，使其水分更易揮發(fā)，通過低溫干制使其含水率低于5%，將含水率作為最后的校正因素之一。同時(shí)，為使花青素被更完全地提取出來，將樣品用研缽進(jìn)行研磨，使其100%過80 目篩，然后進(jìn)行混勻留樣備用。

1.3.2 水分的測定

采用直接稱量法，稱取10 g 左右（稱量誤差控制在0.1 g 以內(nèi)，并精確到0.001 g）1.3.1 中過篩的葡萄籽，稱取量可通過水分測定儀直接讀取，按照水分測定儀操作規(guī)程進(jìn)行水分測定，為使相應(yīng)數(shù)據(jù)更具效力，采用定時(shí)模式進(jìn)行測量，若時(shí)間不足重復(fù)一輪程序即可，直至烘干至恒重；為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，需做3組平行，平行樣誤差在3%以內(nèi)。

1.3.3 花青素提取

稱取3 g 左右樣品（精確到0.000 1 g），加入25 mL 0.8%鹽酸的50%乙醇溶液作為溶劑，同時(shí)在150 W、40 kHz 的條件下進(jìn)行超聲輔助提取，提取時(shí)間設(shè)置為20 min。為確保提取盡可能完全，需反復(fù)過濾、沖洗，使花青素盡可能被完全提取，反復(fù)3 次提取后進(jìn)行溶液轉(zhuǎn)移并用0.8%鹽酸的50%乙醇溶液定容至100 mL的容量瓶中，混勻后待測。

1.3.4 花青素含量的測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱量100 mg 矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，用0.8%鹽酸的50%乙醇溶液準(zhǔn)確定容至100 mL，得到1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)使用液。取7 個(gè)100 mL 干凈的帶刻度比色管，制作兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線，編號分別為B1-0～B1-6，依次在比色管中加入0 ～3.00 mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液，增量為0.50 mL，用0.8%鹽酸的50%乙醇溶液定容至100 mL，混勻待用，標(biāo)液濃度為0 ～30.0 μg·mL-1。測定標(biāo)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行精密度分析。

（2）測定波長的選擇。矢車菊素-3-葡萄糖苷本身具備顏色，無需額外加入顯色劑，可直接進(jìn)行檢測。選擇濃度為標(biāo)準(zhǔn)曲線較為中間的濃度作為測試濃度，波長范圍選取為380 ～780 nm，間隔10 nm 進(jìn)行波長掃描，當(dāng)發(fā)現(xiàn)特征波長，縮小范圍并間隔1 nm 進(jìn)行二次波長掃描，最終確定測定波長。

（3）含量測試。取1.3.3 中的待測樣1.00 mL，用0.8%鹽酸的50%乙醇溶液定容至100 mL，直接在特征吸收波長下進(jìn)行掃描讀值。

（4）精密度實(shí)驗(yàn)。為體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性，選擇60%樣品濃度進(jìn)行6 次平行檢測。即量取15 mL 樣品待測液，分別用0.8%鹽酸的50%乙醇溶液定容至25 mL 混勻后作為精密度實(shí)驗(yàn)的樣品，測量方法與含量測試一致。

（5）加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。量取4 份1.3.3 中的待測液0.50 mL，分別加入0 mL、0.50 mL、1.00 mL和1.50 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液，均置于100 mL 比色管中，用0.8%鹽酸的50%乙醇溶液準(zhǔn)確定容至100 mL，混勻后按照含量測試步驟進(jìn)行上機(jī)檢測，并進(jìn)行加標(biāo)回收率分析，為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每一份加標(biāo)樣品設(shè)置3 組平行，加標(biāo)回收率按式（1）計(jì)算。

式中：c0為標(biāo)液濃度，μg·mL-1；c1為加標(biāo)前樣品的花青素濃度，μg·mL-1；c2為加標(biāo)后的花青素濃度，μg·mL-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分的測定

按照1.3.2 中的步驟進(jìn)行水分測定，稱取的樣品量分別為10.012 g、10.019 g、9.986 g，稱量誤差控制良好；由于葡萄籽含水量較低，一組程序即可滿足測定要求，3次的含水量測試分別為3.97%、4.13%、4.05%。經(jīng)計(jì)算，該組樣品的水分含量平均值為4.06%，RSD=1.32%，精密度符合要求，故測定值有效。

2.2 測定波長的選取

稱取3.016 6 g 葡萄籽樣品，按照1.3.3 和1.3.4進(jìn)行提取和稀釋，得到所需待測液，將待測樣品在380 ～780 nm 間隔10 nm 進(jìn)行波長掃描，經(jīng)過第一輪波長掃描，可以發(fā)現(xiàn)在490 ～530 nm（共計(jì)5 個(gè)點(diǎn)）有特征吸收峰，基本確認(rèn)實(shí)際最大波長在此范圍；在490 ～530 nm 間隔1 nm 進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)在519 nm處有最大吸收，故測定花青素的波長確定為519 nm 處。

2.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.3.4 中標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的要求進(jìn)行含量測定，測試濃度分別為0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、 15.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、25.0 μg·mL-1和 30.0 μg·mL-1，根據(jù)標(biāo)樣濃度分別得到對應(yīng)吸光度為0、0.139、0.288、0.422、0.560、0.700 和0.850。以 標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，校正吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。經(jīng)過線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.028 2x+0.000 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，滿足相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)，能夠作為本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行濃度參照和計(jì)算。

圖1 花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 樣品含量測試

按照1.3.4 中要求進(jìn)行樣品含量測試，經(jīng)過3 個(gè)平行樣的測試，樣品吸光度分別為0.699、0.693、0.698，計(jì)算得到花青素濃度分別為24.783 7 μg·mL-1、 24.570 9 μg·mL-1、24.748 2 μg·mL-1，RSD=0.35%，RSD滿足要求，相關(guān)數(shù)據(jù)有效，計(jì)算得到樣品測試溶液中的花青素含量為24.700 9 μg·mL-1。根據(jù)式（2）計(jì)算得樣品中的實(shí)際花青素含量為247.0 mg，即3.016 6 g 葡萄籽樣品中含有247.0 mg 花青素，葡萄籽中的花青素含量為8.19%。通過校正可得絕干的葡萄籽樣品中花青素的含量為8.53%，由于實(shí)際檢測環(huán)境和物質(zhì)變化的原因，校正值可能存在一定的不準(zhǔn)確性，但具備相對準(zhǔn)確度。

式中：W花青素為花青素的含量，mg·g-1；c為樣品測試溶液中花青素濃度，μg·mL-1；V為待測液體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g；W水為含水率，%。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)分析

按照1.3.4 中要求進(jìn)行操作，可得到6 組平行樣吸光度分別為0.422、0.430、0.427、0.431、0.429 和0.426，其對應(yīng)濃度分別為14.961 0 μg·mL-1、15.244 7 μg·mL-1、15.138 3 μg·mL-1、15.280 1 μg·mL-1、15.209 2 μg·mL-1和15.102 8 μg·mL-1，經(jīng)過t檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，均為有效數(shù)據(jù)。

在精密度實(shí)驗(yàn)分析中，樣品平均濃度為 15.156 0 μg·mL-1，RSD=1.17%，精密性較好，同時(shí)與樣品含量的比值為0.613 6，準(zhǔn)確度也較好。相較于含量測試時(shí)的誤差，精密度實(shí)驗(yàn)有所提升，主要原因是樣品量的提升和濃度減小，但不影響最終有效結(jié)果的選取[4]。

2.6 加標(biāo)回收率測試

按照1.3.4 中要求進(jìn)行測定，加0 mL、0.50 mL、1.00 mL 和1.50 mL 標(biāo)液的加標(biāo)樣品得到吸光度分別為0.352、0.488、0.612 和0.756，對 應(yīng) 濃 度 分 別 為 12.478 7 μg·mL-1、17.301 4 μg·mL-1、21.698 6 μg·mL-1和26.805 0 μg·mL-1。按照式（1）計(jì)算得加標(biāo)回收率分別為96.45%、92.20%、95.51%，該實(shí)驗(yàn)的加標(biāo)回收率為92.20%～96.45%，符合相關(guān)檢驗(yàn)規(guī)范[5]。

3 討論與結(jié)論

本文以巨峰葡萄為實(shí)驗(yàn)原料，經(jīng)過一系列的前處理操作進(jìn)行花青素的提取和測定，并對全過程進(jìn)行精密控制，確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性；同時(shí)，為了盡可能規(guī)避測定誤差，本實(shí)驗(yàn)將含水率作為校準(zhǔn)條件之一，利用真平行和假平行結(jié)合的形式實(shí)現(xiàn)誤差控制，是一種創(chuàng)新體現(xiàn)，能夠?yàn)楹笃趯?shí)驗(yàn)室葡萄中花青素含量的測試提供一定的啟示性建議。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)中也具備一定局限性，測試樣品單一，該樣品只能反映所使用單體的指標(biāo)含量，不能進(jìn)一步做區(qū)域特征分析等廣度性的分析研究。此外，該實(shí)驗(yàn)未比較方法間差異，因此只能代表分光光度法的檢驗(yàn)現(xiàn)象，而對高效液相色譜以及其他更優(yōu)方式的探索和沿用還需進(jìn)一步研究。相信隨著相關(guān)測定技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷精進(jìn)，花青素相關(guān)應(yīng)用的不斷廣度化，人們對花青素的研究將越來越深入。