原花青素和原兒茶酸的協同抗氧化作用

◎ 程菲兒，劉惠卿，張文靜

（山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 太原 030001）

自由基是機體在進行生命活動時產生包含一個非成對電子的原子團[1]。機體健康時產生清除自由基的酶類如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶等保持體內平衡[2]。年齡增長及外部條件作用（如煙酒、輻射、紫外線和農藥等）會使體內自由基過量，引起細胞結構破壞、機體老化，誘發心血管疾病、動脈粥樣硬化等疾病[1]。抗氧化劑的攝入可減少機體內過多自由基造成的危害，其來源可分為天然和人工合成兩類。天然抗氧化劑從果蔬及動物體內獲得，如多酚、維生素等，它們具有抗氧化、消炎、防衰老、抑菌和降血糖血脂等功效，相比人工合成毒性低、效果好[3]。

原花青素（Proantho Cyanidins，PC）和原兒茶酸（Protocatechuic Acid，PCA）是兩種抗氧化性較強的天然抗氧化劑，對自由基的猝滅作用較強。PC 是一類多酚化合物，在葡萄籽、藍莓等植物中大量存在，其含有的多電子酚羥基結構，具有較高的抗氧化活性[4]。低聚PC 能減少線粒體毀壞阻斷細胞衰老進程，增加機體抗氧化性能；在衰老小鼠體內，PC 能顯著增強抗氧化酶類的活性延緩小鼠的衰老速度[5-6]。PCA 是存在于果蔬中的酚酸類物質，能與細胞中活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）結合使其猝滅，降低ROS 含量，減緩細胞損傷和凋亡[7]；還具有抗炎的作用，降低腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）和白細胞介素-1β（interleukin-1β）等促癌因子的生成，減緩炎癥反應[8]。

研究表明，復配后的天然抗氧化劑之間能相互促進，產生顯著的協同抗氧化效果[3]。通過對天然抗氧化劑的種類、濃度等進行優化，探究協同抗氧化能力，有助于降低生產成本，避免抗氧化劑過多使用所帶來的安全問題，對于開發高效、低毒、低成本的抗氧化劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原花青素、原兒茶酸，北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH 自由基），美國Sigma 公司；三氨基甲烷-鹽酸緩沖液（Tris-HCl）、鄰苯三酚和無水乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設備

Spectramax i3x 多功能酶標儀，美谷分子儀器上海有限分公司；SP-1910UVPC 型紫外可見分光光度儀，上海光譜儀器有限公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；BS210S型電子天平，德國賽多利斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制和復配

將PC 溶液制備成10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1和50 mg·L-1的梯度質量濃度，將PCA 配成2 mg·L-1、4 mg·L-1、5 mg·L-1、8 mg·L-1和10 mg·L-1的梯度質量濃度。將PC 與PCA 分別按質量比1 ∶3、1 ∶1 和3 ∶1 進行復配，用于后續清除率測定。

1.3.2 自由基清除率的測定

DPPH 在517 nm 處測定吸光值。DPPH 清除率計算公式為

式中：A1為加入樣液后DPPH 溶液的吸光值；A2為加入樣液后無水乙醇的吸光值；A0為加入蒸餾水后DPPH 溶液的吸光值。

超氧陰離子320 nm 處測定吸光度，超氧陰離子清除率計算公式為

式中：A1為樣液、鄰苯三酚和Tris-HCl 混合溶液的吸光值；A2為樣液、蒸餾水和Tris-HCl 混合溶液的吸光值；A0為以蒸餾水、鄰苯三酚和Tris-HCl 混合溶液的吸光值。

1.3.3 Isobologram 分析法

實驗計算出PC 和PCA 各自的半數清除濃度及95%置信限，并計算出復配物的半數清除濃度。繪制PC 和PCA 的IC50值和95%置信度，將樣品復合后得到的IC50值繪入坐標內。

1.3.4 統計學方法分析兩種原料的相互作用

實驗通過計算相互作用指數γ評價復配能力。復配物的理論IC50add值計算公式為

式中：Q為A、B 兩種抗氧化劑單獨作用時的效價比，即Q=IC50A/IC50B；K1、K2分別為抗氧化劑A、B 在復配體系中所占的比例，K2=1-K1。

通過上述實驗能夠算出復合物實際上消滅50%自由基時所需的濃度，即IC50mix值。得到PC 和PCA 復配后理論上猝滅50%自由基所需的濃度，即IC50add值[9]。將二者進行比較，若IC50mix＜IC50add，即可證明兩種樣品復配之后具有協同抗氧化活性。

復配物之間協同作用的強弱用γ值來表示，計算公式為

式中：IC50Amix、IC50Bmix分別為復配體系中A、B兩種抗氧化劑各自的IC50值；IC50A、IC50B分別為A、B 兩種抗氧化劑單獨作用時的IC50值。若γ=1，表示相互作用為相加；若γ＜1，表示二者之間存在協同，γ值越低藥物之間的協同作用越強；若γ＞1，表示相互作用為拮抗作用。

2 結果與分析

2.1 PC 和PCA 清除自由基的能力

由圖1（a）可知，PCA 的濃度達到10 mg·L-1時，清除率為28.98%，PC 濃度為50 mg·L-1時，清除率為41.59%。PC 與PCA 的半數清除濃度分別為60.32 mg·L-1、 17.53 mg·L-1。猝滅超氧陰離子自由基的強弱順序為PCA ＞PC。由圖1（b）可知，PC、PCA 消滅自由基的比例與濃度成正比，最后達到穩定。當PCA 的濃度是10 mg·L-1時，它能消滅78.44%的DPPH，而此時PC 的清除率僅為39.20%。當PC 的濃度為50 mg·L-1時，其清除率達到85.62%。PC 和PCA 的IC50值分別為13.66 mg·L-1和5.80 mg·L-1。清除DPPH 自由基的強弱順序為PCA ＞PC。

圖1 PC 和PCA 對自由基的清除率圖

2.2 Isobologram 法評價PC 和PCA 的相互作用

2.2.1 PC 和PCA 復配后對自由基清除率的測定

PC 和PCA 復配后對于自由基的清除率如表1 所示。二者復配的實際的IC50mix值見表2。

表1 不同比例PC 和PCA 對DPPH、超氧陰離子自由基的清除率表

表2 PC 和PCA 復配后清除DPPH、超氧陰離子自由基的IC50mix 值表

2.2.2 復配后的Isobologram 分析圖

根據表1、表2 繪制復配物對DPPH 自由基、超氧陰離子自由基清除率的等輻射分析，如圖2 所示，PC 和PCA 復配后作用點均位于相加線及95%置信區的下方，這表明二者之間為協同作用。

圖2 PC 和PCA 復配后清除自由基的Isobologram 分析圖

2.3 統計學分析

計算復配組對DPPH 自由基、超氧陰離子自由基理論上的IC50add值，將IC50mix值與IC50add值進行比較，結果見表3。

表3 PC 和PCA 復配后的統計學分析表

由表3 可知，對于自由基指標下的每一個復配比的理論IC50mix值都比實驗IC50add值小，各組合的γ值也均小于1。即證明PC與PCA按不同比例重新組合后，復合物清除自由基的效果比樣品單獨作用時強，具有協同效果。結果表明，PC 和PCA 復配對超氧陰離子的清除能力更強，其相互作用指數可達0.28。在清除DPPH 自由基時，PC ∶PCA 復合后的抗氧化性次序為3 ∶1 ＞1 ∶1 ＞1 ∶3；在清除超氧陰離子自由基時，復配組的抗氧化性的次序為1 ∶1 ＞3 ∶1 ＞1 ∶3。

3 討論

PC 和PCA 都具有較強的抗氧化效果。本研究將PC 和PCA 復配，利用等輻射分析法并輔助相互作用指數對結果進行評價，從而較為全面地分析了復配的協同抗氧化作用。等輻射分析法又稱Isobologram 分析法，被稱為評價藥物間相互作用的“黃金標準”。通過繪制等輻射分析圖，從而說明樣品間的相互作用，可以簡單、有效地評估樣品在復配后的聯合應用效果。通過統計學分析得到的γ值對得到復合抗氧化劑產生最佳抗氧化效果的復配比提供一定的參考依據。通過Isobologram 分析法得到PC 和PCA 復配后的抗氧化效果優于兩種單一成分，在對不同的自由基產生作用時，復配比不同，結果也不同。周甜甜等[10]在關于落葉松樹皮與藍莓花青素的協同抗氧化研究中，得到的γ值集中在0.5 ～0.9，協同作用最強時，γ值為0.54。而PC 和PCA 復配后清除自由基時，其γ值甚至可以達到0.28，充分證明了PC 和PCA 協同抗氧化性較強。龔艷振等[11]在關于天然抗氧化劑復配研究進展中提到，抗氧化劑復配后在一起發揮協同作用的機理主要有修復再生或新生、偶聯氧化、吸收氧氣以及抗氧化劑之間的相互作用等。段方娥等[12]對在辣椒素與槲皮素、蘆丁協同抗氧化作用的研究中提到辣椒素與槲皮素、蘆丁復合后的協同抗氧化性強于單一成分，其可能機制是抗氧化性相對較弱的辣椒素能修復再生抗氧化性強的槲皮素和蘆丁，反應體系中出現了完整的氧化還原回路，使得復配物的協同抗氧化性增強。PC 和PCA 復配后對于自由基清除率增強，也可能是因為氧化能力較弱的PC 對抗氧化能力較強的PCA 產生了一定的修復作用，使得復配之后的復合相較于兩種單一作用有較好的協同抗氧化效果。多酚類物質與其他抗氧化劑復配后發生協同作用的機理可以解釋為基于氧化還原電位差的偶聯氧化。而PCA 也是一種抗氧化性較強的多酚類物質，有理由推斷其與PC 發生協同抗氧化的機理是因為發生了偶聯氮化。

4 結論

PC 和PCA 在對于自由基的清除中均能發揮出很強的作用，但是由于反應體系不同，因此抗氧化效果也會存在一定的差異。PC 和PCA 在復配后的抗氧化活性強于單一組分，并且二者復配比的差異也對復合物的協同抗氧化效果有所影響。因此，在后續的研究中需要進一步探討復合抗氧化劑的最佳配比，使其發揮出最大的協同抗氧化性，從而能更好地指導生產實踐，為其他酚類物質復合抗氧化劑的開發提供一定的參考價值。