甘油二酯的酶法合成及純化工藝研究進(jìn)展

◎ 梅 嵐，李祎銘

（脂代科技（北京）有限公司，北京 100089）

甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）是一種天然存在的來(lái)源于多種食用油脂的微量組分，也是油脂在人體代謝的中間產(chǎn)物，是公認(rèn)的安全食品成分，具有營(yíng)養(yǎng)、人體相容性高等優(yōu)點(diǎn)，其在色澤、風(fēng)味、口感上與食用油脂中的主要成分甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）無(wú)異[1-2]。

1 甘油二酯概述

DAG 由于在緩解糖尿病等與營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的慢性代謝性疾病、抑制脂肪堆積方面有著重要的生理作用而受到廣泛關(guān)注。DAG 根據(jù)脂肪酸與羥基結(jié)合的位點(diǎn)不同，可分為1,3-DAG 與1,2-DAG 兩種異構(gòu)體（圖1），其中CO-R、CO-R1為飽和或不飽和脂肪酰基。由于空間位阻效應(yīng)，1,3-DAG 在熱力學(xué)上比1,2-DAG 更穩(wěn)定。約70%的DAG 以1,3-DAG 形式存在于食用油脂中[3]；而1,2-DAG 主要存在于油脂代謝中間產(chǎn)物中。不同種類的食用油中DAG 含量不同，見表1[4]。

表1 食用油中DAG 的含量表（單位：%）

圖1 甘油二酯的兩種結(jié)構(gòu)示意圖

天然存在的DAG 很少，主要以普通油脂為原料，通過化學(xué)方法或生物酶法合成[5-6]。采用化學(xué)方法所需的化學(xué)試劑需通過額外步驟去除和回收，且工藝條件較苛刻（溫度220 ～260 ℃），會(huì)產(chǎn)生較高的運(yùn)行成本，同時(shí)高熱環(huán)境可能導(dǎo)致熱敏性的多不飽和脂肪酸降解。因此，目前DAG 的生產(chǎn)極少使用化學(xué)方法。酶法由于環(huán)境友好、反應(yīng)溫和、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)而被廣泛使用。

脂肪酶催化的酶法提供了幾種合成DAG的途徑。①脂肪酸和甘油之間的酯化反應(yīng)。②TAG 和甘油之間的甘油解反應(yīng)。③TAG 的部分水解反應(yīng)。④TAG和MAG 之間的酯交換或部分水解和酯化的組合。盡管酶法是合成DAG 的首選方法，但其生產(chǎn)成本往往較高。一般通過固定化的方法使酶穩(wěn)定并重復(fù)利用，從而降低酶法合成DAG 的成本。通常情況下，酶反應(yīng)后產(chǎn)生的DAG 通過柱層析、分子蒸餾等進(jìn)一步純化從而消除反應(yīng)過程中形成的副產(chǎn)物，如游離脂肪酸（Free Fatty Acid，F(xiàn)FA）、MAG 和TAG，以達(dá)到食品級(jí)DAG 的產(chǎn)品要求[7]。

2 甘油二酯的酶法合成

2.1 酯化反應(yīng)

酯化是以甘油和脂肪酸為原料，以脂肪酶為催化劑，制備DAG。在酯化過程中，會(huì)生成TAG、MAG等副產(chǎn)物（圖2）。在酯化反應(yīng)中生成的水不僅會(huì)阻礙反應(yīng)的正向進(jìn)行，而且會(huì)降低脂肪酶的活性，所以控制適當(dāng)?shù)乃恐陵P(guān)重要。通常情況下，游離脂肪酸的供應(yīng)量大于甘油，以提供足夠的游離脂肪酸與甘油酯化，但不能過量，以免在反應(yīng)結(jié)束時(shí)難以去除或因酸度高而影響脂肪酶活性。李相等[8]以諾維信435 為催化劑，調(diào)整油酸和甘油的物質(zhì)的量比為2.27 ∶1.00，在真空除水的條件下反應(yīng)6 h，可以得到含量為70wt%的DAG。直接酯化法具有反應(yīng)時(shí)間短、產(chǎn)物純度高、反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，但因游離脂肪酸非常昂貴，因此直接酯化法的成本較高。因此，LO等[9]用玉米和大豆油脫臭餾出物中的脂肪酸與甘油進(jìn)行了酶促酯化反應(yīng)，經(jīng)純化后DAG 的純度可高達(dá)84wt%。脫臭餾出物作為DAG 合成的廉價(jià)原料，間接降低了DAG 的生產(chǎn)成本。但當(dāng)其用于食用油時(shí)，餾出物中的雜質(zhì)仍然令人堪憂。類似的研究還有使用椰子油和葵花籽油的混合除臭餾出物來(lái)生產(chǎn)DAG。該研究采用了一種不同的DAG 合成方法，其中脫臭餾出物經(jīng)過兩步酶促反應(yīng)，先水解，使游離脂肪酸完全釋放，再將水解的游離脂肪酸與甘油酯化。與一步酯化法相比，使用該方法再純化后得到的DAG 純度可高達(dá)70wt%～94wt%[10]。

2.2 部分水解法

部分水解法是將TAG 與水和酶反應(yīng)，得到DAG、MAG 和FFA 的混合物，再通過分子蒸餾去除水、MAG、FFA和殘留的TAG，得到高純度的DAG，見圖3。部分水解法反應(yīng)過程簡(jiǎn)單、成本低廉，但該過程會(huì)引入水，可能會(huì)降低油的品質(zhì)，特別是多不飽和脂肪酸含量高的油。CHEONG 等[11]采用固定化脂肪酶通過部分水解法生產(chǎn)棕櫚基DAG，粗提純后的DAG 經(jīng)純化后可獲得純度約90wt%的棕櫚基DAG。有研究表明，在反應(yīng)發(fā)生前，水在脂肪物質(zhì)中的溶解度先影響反應(yīng)速率。因此，部分水解反應(yīng)中通常會(huì)加入有機(jī)溶劑或表面活性劑，從而增加反應(yīng)物的互溶性，提高DAG的產(chǎn)率[12]。此外，反應(yīng)物對(duì)酶分子活性部位的可及性，尤其是在固定化酶形式下，對(duì)水解反應(yīng)有顯著的影響。水分子還可與酶分子結(jié)合形成穩(wěn)定的水酶復(fù)合物，在部分水解反應(yīng)體系下與TAG 競(jìng)爭(zhēng)，所以當(dāng)水含量超過一定的臨界限度時(shí)，TAG 的水解受到抑制。

圖3 部分水解法制備甘油二酯圖

2.3 甘油解法

甘油解法是生產(chǎn)DAG 最經(jīng)濟(jì)的方法。酶法甘油解是以TAG 和甘油為原料，在脂肪酶的催化下制備DAG的方法，具體反應(yīng)見圖4。在甘油解過程中，甘油是逐步加入的，以免甘油吸附在脂肪酶的活性部位而影響其催化活性[13]。KAHVECI 等[14]以甘油和菜籽油為原料，以諾維信435 為催化劑，制備了含量在40%～50% 的1,3-DAG。與部分水解法相似，有時(shí)會(huì)在甘油解反應(yīng)中加入食品級(jí)表面活性劑，以克服甘油與油脂不混溶的問題。最近一項(xiàng)研究表明，超聲波預(yù)處理可促進(jìn)豬油中DAG 的產(chǎn)生。一定強(qiáng)度的超聲功率強(qiáng)度會(huì)提高脂肪酶催化反應(yīng)速率，但過高的超生功率強(qiáng)度可能導(dǎo)致脂肪酶失活從而降低反應(yīng)速率。同時(shí)，超聲波可提高底物和脂肪酶的混溶性，但規(guī)模生產(chǎn)時(shí)能耗和成本較高[15]。

圖4 酶法甘油解制備甘油二酯圖

2.4 酯交換

酯交換法是以TAG 和MAG 為原料，在脂肪酶的催化下生成DAG。酯交換法分為兩步，先是TAG 的水解反應(yīng)，再是TAG 水解后的脂肪酶與MAG 間的酯化反應(yīng)，水解和酯化兩步反應(yīng)的平衡是關(guān)鍵也是難點(diǎn)。同時(shí)，MAG 成本較高，不利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。

3 DAG 的純化方法

在生產(chǎn)DAG的過程中，需對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，去除MAG 等副產(chǎn)物，從而得到高純度的DAG。常用的純化方法有溶劑結(jié)晶法、柱層析法、超臨界CO2萃取法和分子蒸餾法[16]。

3.1 溶劑結(jié)晶法

溶劑結(jié)晶法利用混合物中脂肪酸、MAG、DAG和TAG 在特定溶劑中不同溫度下的溶解度差異控制不同的溫度使各組分得以結(jié)晶分離。此法的關(guān)鍵在于選擇合適的溶劑及結(jié)晶溫度。此法操作簡(jiǎn)單、成本低廉，但僅適用于溶解度不會(huì)隨著溫度變化而改變的物質(zhì)，并且存在工業(yè)生產(chǎn)低溫結(jié)晶難度較大、有機(jī)溶劑殘留等缺點(diǎn)。

3.2 柱層析法

柱層析法需選擇合適的液體洗脫劑及固體吸附劑，利用吸附劑對(duì)混合物各組分的吸附能力與脫附能力不同，通過柱內(nèi)吸附劑的不斷吸附及脫附作用，使各組分依次被洗脫下來(lái)，實(shí)現(xiàn)分離純化。國(guó)外專利報(bào)道已實(shí)現(xiàn)采用離子交換樹脂[17]和分子篩[18]作為吸附劑，分離MAG、DAG 及TAG。MAEKAWA 等[19]將離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為洗脫劑對(duì)MAG 進(jìn)行洗脫分離，得到了最終純度為95%的MAG。ZINNEN 等[17]用柱層析法實(shí)現(xiàn)了MAG、DAG、TAG 的高效分離。柱層析法對(duì)真空度的要求比分子蒸餾低，成本相對(duì)較低，但處理能力低，且僅處于實(shí)驗(yàn)室階段，尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

3.3 超臨界CO2 萃取法

當(dāng)CO2溫度高于31.26 ℃且壓力高于7.38 MPa 時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槌R界狀態(tài)。利用超臨界CO2在特殊天然產(chǎn)物中溶解度增加而將各組分萃取出來(lái)，然后通過升溫或減壓下使CO2逸出后得到目標(biāo)產(chǎn)物，這是近年來(lái)DAG 的最新分離方法[20]。超臨界CO2具有無(wú)腐蝕、高純度、無(wú)毒和價(jià)格低的優(yōu)點(diǎn)，既如氣體又如液體，具有較好的滲透性。但此法的缺點(diǎn)是操作壓力較高，工業(yè)化成本較高。

3.4 分子蒸餾法

分子蒸餾又名短程蒸餾，是在一定溫度和真空度下，利用不同物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的平均自由程差異實(shí)現(xiàn)液液分離的方法。此法具有操作溫度低、真空度高、受熱時(shí)間短、分離程度高等特點(diǎn)，適合于分離純化高沸點(diǎn)、熱敏性和易氧化的天然產(chǎn)物，能克服傳統(tǒng)蒸餾方法易引起熱敏性和易氧化成分的高溫破壞，并能分離沸點(diǎn)高和沸點(diǎn)差異小的物質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于DAG 的純化過程[21]。

4 結(jié)語(yǔ)

酶法合成特定結(jié)構(gòu)的DAG以及純化技術(shù)的發(fā)展，不僅促進(jìn)了DAG 的產(chǎn)業(yè)化，而且滿足了消費(fèi)者對(duì)不同功能性脂肪酸DAG 的需求，彌補(bǔ)了DAG 在食品領(lǐng)域的空缺。其中，經(jīng)濟(jì)性較高的甘油解法由于產(chǎn)品產(chǎn)率高、反應(yīng)時(shí)間短等特點(diǎn)常與操作溫度低、分離效率高的分子蒸餾法相結(jié)合，作為DAG 生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)路線，具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。