煙葉病害大數據庫建立與運用

戴 恩，田 華，李 龍，周 亮，翟國帥

1.云南省煙草公司 昆明市公司，云南昆明 650051；2.北京佰司特貿易有限責任公司，北京 100021

1 煙草花葉病的概述情況

云南是中國最重要、規模最大的“兩煙”生產基地，煙草是云南省重要經濟支柱之一。云南的高原氣候和土壤條件為煙草作物種植提供了良好的天然生態環境，加上科學種植和精心管理，建立和鞏固了優質煙葉基地。然而，病毒病的普遍發生嚴重影響煙葉的產量和質量，造成嚴重的經濟損失，在我國部分煙區已上升為煙草的第一大病害[1-2]。

煙草花葉病毒 （Tobacco mosaic virus，TMV），為RNA病毒，是煙草花葉病等的病原體，屬于Tobamovirus群[3]。TMV侵染煙草引起的煙草病毒病是我國煙草上發生最普遍、危害最嚴重的病害之一，廣泛分布于我國廣大煙區，尤其是南方煙區發生較為普遍且日益加重，一般發病率為5%～20%，給煙草產業造成了巨大的經濟損失[4]。目前煙草普通花葉病還沒有治療的特效藥，防治時一定要做到“預防為主、綜合防治”[5]。

2 煙草花葉病毒的檢測方法簡介

時間分辨熒光分析法（Time-resolved fluoraimmunoas say，TRFIA）是近年來發展起來的一項新的標記免疫分析技術，使用三價銪離子（Eu3+）螯合物作為示蹤劑標記抗體與相應待測抗原特異性結合成抗原抗體復合物，此復合物在增強液中解高后在特定的激發光下發出特定的熒光，以時間分辨熒光納米顆粒為標記載體和信號輸出單元，以特異性抗體為識別單元，使用熒光檢測儀對定量檢測卡上熒光信號進行讀取，當檢材中含有目標檢測物時，熒光信號隨著含量的增加而變化，利用濃度和變化的關系建立的標準曲線進行準確定量。時間分辨熒光定量快速檢測技術具有標記物穩定、抗干擾強、檢測結果重復性好、操作較簡便、檢測時間較短的優點，也可用于現場篩查靈敏度高，比膠體金靈敏度高2～3個數量級。

3 材料與方法

3.1 材料

鮮煙葉、煙草花葉病毒熒光定量檢測試紙條（試紙條所用耗材見表1），緩沖液、熒光定量檢測儀等（實驗所用藥品及儀器見表2）。

表1 主要耗材

表2 主要儀器、試劑表

3.2 方法

3.2.1 煙草花葉病毒熒光定量試紙條的組裝 在PVC支持板上，按順序黏貼附著固相抗體的硝酸纖維素膜、吸收墊、玻璃纖維素膜、樣品墊（圖1），膜與墊、墊與墊間留有1～2 mm的重疊，重疊間隙不要留氣泡，用剪刀將粘貼好的試紙條剪成寬3 mm左右，常溫避光下干燥保存。

圖1 熒光定量試紙組裝圖

3.2.2 樣品采集 2021年7月從云南各地7個煙站采集鮮煙葉，共計15 000個樣本，將其編號后進行煙草花葉病毒的檢測。各個煙站采樣情況見表3。

表3 7個煙站采樣詳情

3.2.3 實驗操作步驟 先用天平取0.5g鮮煙草樣本至含有緩沖液的1.5 mL離心管中，使用搗棒上下搗10～15次，搗碎。熒光檢測儀開機預熱幾秒，從包裝袋中取出試紙條。再用移液器取搗碎的樣本液100 L垂直滴于試紙條進樣孔中。將滴過液的試紙條插入熒光定量檢測儀的樣品孔中，然后按測定，最后獲得樣品中花葉病菌數量，記錄數據。

煙草花葉病毒濃度閾值判定的標準是根據agdia的膠體金條進行確定的，濃度閾值3 ng/mL檢出為陰性，3～10 ng/mL為弱陽，10～100 ng/mL為中強陽，＞100 ng/mL為強陽。

3.2.4 數據處理 采用Excel 2007軟件處理所得數據。

4 結果與分析

對云南省昆明市石林縣7個煙站檢測結果統計顯示，石林煙站樣品檢測量為2 000個，其中花葉病陽性個數為15個，陽性率為0.75%，相對來說陽性率不高，相關部門應提前做好預警及防控；鹿阜煙站樣品檢測量為2 000個，其中花葉病陽性個數為96個，陽性率為4.80%，相對來說陽性率處于可控制范圍內，相關部門需做好預警及防控；長湖煙站樣品檢測量為2 500個，其中花葉病陽性個數為5個，陽性率為0.20%，相對來說陽性率不高，仍需做好預警和防控；西街口煙站樣品檢測量為2 000個，其中花葉病陽性個數為33個，陽性率為1.65%，相對來說陽性率處于可控范圍，仍需做好預警和相關防控；大可煙站樣品檢測量為2 000個，其中花葉病陽性個數為55個，陽性率為2.75%，相對來說陽性率處于可控范圍，仍需做好預警和相關防控；板橋煙站樣品檢測量為2 000個，其中花葉病陽性個數為643個，陽性率為32.15%，陽性率相對其他幾個煙站是最高的，因此板橋煙站需引起重視，做好預警方案和防控措施，避免花葉病擴散，有必要的話可更換煙草品種或實行輪作制度；圭山煙站樣品檢測量為2 500個，其中花葉病陽性個數為5個，陽性率為0.20%，相對來說陽性率不高，仍需做好預警和相關防控。

7個煙站陽性率的大小依次為：板橋煙站＞鹿阜煙站＞大可煙站＞西街口煙站＞石林煙站＞長湖煙站、圭山煙站。此次采集云南省昆明市石林縣7個煙站樣品量共15 000個，其中陽性個數為852個，陽性概率為5.68%（表4、圖2）。

圖2 7個煙站花葉病檢測數據統計圖

表4 7個煙站煙葉病害檢測匯總表

5 討論

云南煙草常年種植面積超過35萬hm2，超過全國的1/3。近年來，煙草病毒病已經成為煙草病蟲害中損失最大的一類病害[6]。2003年云南省煙草因病毒病造成的損失達4 800多萬元[7]。因此，煙草病毒病害的防治成為煙草植保工作的首要任務。我國在該病毒的檢測方法上主要有PCR法。本次通過熒光定量快速檢測法，具有操作簡單、靈敏度高、特異性強、檢測速度快、檢測成本低的優點，為煙草花葉病病害提供了快速、準確的檢測手段，并建立了煙草花葉病病毒數據分析和模型。

6 結論

（1）通過熒光定量快速檢測法，對云南省昆明市石林縣7個煙站的樣品進行花葉病病害檢測，建立了云南省煙草公司昆明市公司煙葉病害花葉病數據庫，根據檢測數據結果統計分析，建立煙草花葉病病毒病的預警機制及防控措施。

（2）時間分辨熒光法快速檢測試紙條檢測煙草花葉病毒閾值判定的標準是根據agdia的膠體金條進行確定的，閾值定為3 ng/mL時與agdia的膠體金條陰陽性能完全符合，且檢測時間只需10 min，可用于對TMV的定量檢測，適合用于實驗室或田間對TMV感染癥狀的研究及評估，滿足對TMV更高靈敏度檢測的需要。

（3）建立煙葉病害大數據庫，建立大數據技術的戰略意義在于對龐大的、含有意義的數據進行專業化處理，是實時交互式的查詢效率和分析能力。對煙草病害來說，建立數據庫需前期對各地的煙草品種進行大量檢測，歸納整理，以期發現一定規律，便于制定適合各地煙草品種相關病害預防、控制、管理方案。