ADCY9基因與兒童支氣管哮喘的易感性及環境交互作用分析

賈京晶 魏兵 李令雪 任夢洋, 張世楠 劉俊 張宇璇,

（1.錦州醫科大學北部戰區總醫院研究生培養基地，遼寧沈陽 110016；2.中國人民解放軍北部戰區總醫院，遼寧沈陽 110016）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是兒童時期最常見的慢性呼吸道疾病之一，以慢性氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為特征的異質性疾病［1］。近年來，兒童哮喘呈起病年齡逐漸變小，患病率逐漸上升的趨勢。我國兒童哮喘患病率已經從1990年的0.91%，上升為2010 的3.02%［2-3］。哮喘已經成為全球范圍內嚴重的公共衛生問題之一，然而哮喘的發病機制尚未明確，目前認為其是由多種遺傳因素和環境因素間復雜的相互作用引起的［4-5］。腺苷酸環化酶9 （adenylyl cyclase Ⅸ，ADCY9）基因位于染色體16p13.3 區，該基因編碼一種膜結合酶，分布比較分散，在肺和其他組織中均廣泛表達。研究表明ADCY9基因可能與哮喘、瘧疾和鐮狀細胞病等具有相關性［6］。目前國外關于ADCY9基因多態性與兒童哮喘的關系僅有1 篇研 究，結果顯示ADCY9基 因rs2601814 和rs2601796 位點與巴西兒童哮喘易感性有關［7］，國內暫無相關研究報道。本研究為國內外首次探討ADCY9基因rs1967309、 rs2230739、 rs2601814、rs2601825、rs2601796 和rs2283497 位點單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與中國兒童哮喘易感性及基因-環境交互作用的關系，以探索兒童哮喘的發病機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究為病例-對照研究，選取2019年3月至2021年9月就診于中國人民解放軍北部戰區總醫院的哮喘患兒123例為哮喘組，均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》的診斷標準［1］。根據哮喘急性發作嚴重程度分為輕中度84例（68.3%），重度39 例（31.7%）。對照組兒童選取同期于我院健康體檢的兒童124例。所有入組兒童均為東北地區漢族兒童，三代內無血緣關系，無自身免疫疾病和其他病史。哮喘組和對照組兒童性別、入組年齡及體重指數（body mass index，BMI）差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。本研究經我院倫理委員會批準［倫理Y（2020）054號］，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

表1 研究對象基本情況

1.2 ADCY9基因SNPs的測定

分別采集2 組研究對象外周血3 mL 于真空靜脈采血管中，采用DNA 提取試劑盒（上海天昊科技生物有限公司）提取DNA，應用Primer 3軟件設計聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物（生工生物工程上海股份有限公司），利用引物對ADCY9基因6 個位點進行擴增，引物信息見表2。PCR 反應體系包含10 倍PCR 反應緩沖液，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP 混合液，1 U Tap酶，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物；反應條件： 95℃2 min， 94℃20 s， 65℃40 s， 72℃1.5 min，共35 個循環。PCR 產物純化后采用ABI3730XL測序儀進行基因測序，ADCY9基因6個位點電泳峰型見圖1~6。

圖1 rs1967309位點電泳峰型圖

表2 引物信息

1.3 統計學分析

應用SPSS 23.0 軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，不符合正態分布的計量資料采用中位數（四分位數間距）［M（Q1，Q3）］表示，2組間比較采用兩樣本t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。計數資料用例數和構成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。應用logistic 回歸分析對ADCY9基因與兒童哮喘易感性進行分析，以比值比（odds ratio，OR）及95%置信區間（confidence interval，CI）評估相對風險度。應用廣義多因子降維法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR） 分 析ADCY9基因與環境因素的交互作用，得出最優模型后，應用二元logistic 回歸分析進行驗證。連鎖不平衡及單倍型分析采用Haploview 軟件，當連鎖不平衡系數（D'）>0.8 時存在強連鎖不平衡。P<0.05為差異具有統計學意義。

圖2 rs2230739位點電泳峰型圖

圖3 rs2601814位點電泳峰型圖

圖4 rs2601825位點電泳峰型圖

圖5 rs2601796位點電泳峰型圖

圖6 rs2283497位點電泳峰型圖

2 結果

2.1 ADCY9基因6個位點基因型及等位基因在哮喘組和對照組的分布

應用Hardy-Weinberg平衡檢驗ADCY9基因6個位點分布情況，結果顯示哮喘組及對照組符合遺傳平衡定律（均P>0.05），說明研究對象具有良好的代表性。rs1967039 位點基因型和等位基因在哮喘組和對照組的分布差異有統計學意義（P<0.05）。經logistic 回歸分析顯示rs1967039 位點中GA 和AA基因型兒童哮喘患病風險分別為GG基因型兒童的0.493、0.395 倍，攜帶A 等位基因兒童患哮喘的風險是攜帶G 等位基因兒童的1.755 倍（P<0.05）。rs2230739、rs2601814、rs2601825、rs2601796 和rs2283497 位點基因型及等位基因在哮喘組和對照組的分布差異均無統計學意義（均P>0.05）。見表3。

表3 哮喘組和對照組的ADCY9基因6個位點基因型及等位基因比較 ［n（%）］

2.2 ADCY9基因6個位點基因型及等位基因與兒童哮喘急性發作嚴重程度的關系

ADCY9基因6 個位點基因型及等位基因在輕中度兒童和重度兒童的分布差異均無統計學意義（P>0.05），見表4。

表4 ADCY9基因SNPs與不同哮喘急性發作嚴重程度的關系 ［n（%）］

2.3 ADCY9 基因6 個位點連鎖不平衡及單倍型分析

ADCY9基 因rs2601796 和rs2601814 位 點D'為0.98，表明2 位點間存在強連鎖不平衡，構成TA和GG 2 種單倍型。單倍型TA 和GG 在哮喘組和對照組的分布差異無統計學意義（P>0.05）。單倍型TA和GG在不同哮喘急性發作嚴重程度中的分布差異無統計學意義（P>0.05）。見表5~6。

表5 哮喘組和對照組單倍型TA和GG分布頻率比較［n（%）］

表6 不同哮喘急性發作嚴重程度單倍型TA和GG分布頻率比較 ［n（%）］

2.4 ADCY9基因6個點位間的交互作用分析

應 用 GMDR 分 析 rs1967309、 rs2230739、rs2601814、rs2601825、rs2601796 和rs2283497 位點之間的交互作用， 結果顯示rs1967309、rs2230739、rs2601814、rs2601825、rs2601796 和rs2283497 位點交叉一致性為100%，為最佳模型，但6個位點間顯著性檢驗差異無統計學意義（均P>0.05）。見表7。

表7 ADCY9基因各位點間的交互作用GMDR分析結果

2.5 ADCY9基因與環境交互作用分析

采用GMDR 分析母乳喂養、變應原接觸、環境煙草煙霧（environmental tobacco smoke，ETS）接觸、寵物接觸及城市居住地與rs1967309 位點的交互作用。由表8可以看出，二階模型及六階模型交叉一致性均為10/10，但二階模型檢驗樣本準確性（0.661）高于六階模型（0.600），故選擇二階模型為最佳模型（圖7）。二階模型交互作用顯著性檢驗差異有統計學意義（P<0.05），即rs1967309位點與變應原接觸的交互作用有統計學意義。對ADCY9基因各位點間及其與環境交互作用交叉一致性為100%的模型進行logistic回歸分析驗證，結果顯示rs1967309 位點與變應原接觸的交互作用使哮喘的患病風險增加（OR=1.585，P<0.05）。見表9。

表9 交叉一致性為100%的模型logistic回歸分析

圖7 ADCY9基因rs1967309位點與環境交互作用的GMDR分析結果最佳模型

表8 ADCY9基因rs1967309位點與環境交互作用GMDR分析結果

3 討論

近二三十年來，在全球范圍內兒童哮喘的發生率迅速升高，尤其是經濟發達的國家和地區［8］，嚴重影響了人們的身心健康。早期哮喘風險的評估對高風險兒童至關重要，若能進行有效的早期評估，采取早期預防能很大程度降低高風險兒童哮喘的發病率。哮喘是多基因控制的呼吸系統慢性疾病，其發病受遺傳、環境等因素影響。ADCY9基因受G 蛋白耦合受體、蛋白激酶和鈣家族的調節， 催化三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）轉化為第二信使環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），ADCY9基因表達的減少導致cAMP生成減少，進而引起免疫調節失衡［9］。此外，β2腎上腺素能受體在ADCY9基因的介導下可被激活，該通道對平滑肌及肺功能調節起著重要作用［10-11］。

本研究對ADCY9基因6 個位點的SNPs 與兒童哮喘易感性進行分析，結果顯示rs1967309 位點檢測出GG、GA和AA 3種基因型，與Kim等［12］分析韓國輕中度哮喘患者ADCY9基因多態性相同，基因型及等位基因在哮喘組和對照組的分布差異存在統計學意義，表明該位點是兒童哮喘的易感位點，其中AA基因型在哮喘組中的分布頻率低于對照組，次等位基因A降低了兒童患哮喘的風險，提示其是兒童哮喘的保護因素。我們推測可能次等位基因A 參與了蛋白激酶A 的正向調控，cAMP 生成增多，使ADCY9活性增加。Teixeira等［7］研究了ADCY9基因多態性與1 309例巴西兒童哮喘和過敏的相關性，發現rs2601814 和rs2601796 位點的SNPs 增加了哮喘兒童的患病風險，rs2283497 位點與兒童過敏有關。本研究未發現rs2601814、rs2601796和rs2283497位點與兒童哮喘患病風險增加存在關聯，考慮可能受到地域、種族和樣本量的影響。此前有研究證實rs2230739 位點與瘧疾的患病有關［13-14］，目前暫無該位點與兒童哮喘的相關性研究，我們發現rs2230739 位點與兒童哮喘易感性無關。本研究中rs2601825位點檢測出TT、TC和CC基因型，經分析發現該位點不是兒童哮喘的易感位點。ADCY9基因位于β2腎上腺素能受體下游［9］，β2腎上腺素能受體與哮喘急性發作密切相關［15］，因此我們對ADCY9基因與哮喘急性發作嚴重程度進行研究，結果顯示ADCY9基因6 個位點的SNPs與哮喘急性發作嚴重程度無關。

連鎖不平衡指的是不同遺傳標記間存在著的非隨機組合［16］，單倍型是共同出現在單條染色體上的遺傳變異位點的組合［17］。目前越來越多的學者致力于單倍型與復雜性疾病的研究［18-19］。我們是國內外首次對ADCY9基因單倍型與兒童哮喘的關系進行研究，結果顯示rs2601796和rs2601814位點共構成TA和GG 2種單倍型，TA和GG單倍型在哮喘組和對照組中及在不同哮喘急性發作嚴重程度中的分布差異均無統計學意義，提示這2種單倍型與兒童哮喘的發病及急性發作嚴重程度無關。

哮喘是由基因-基因、基因-環境交互作用引起復雜性疾病［20］，了解其交互作用，篩選出哮喘易感人群，避免環境觸發因素，能夠對兒童哮喘進行早期診斷及有效干預。有研究表明變應原接觸、寵物接觸、ETS接觸、城區居住地及非母乳喂養均是兒童哮喘發生的危險因素［21-24］。本研究首次探討ADCY9基因與環境交互作用的關系，結果提示rs1967309、rs2230739、rs2601814、rs2601825、rs2601796 和rs2283497 位點不存在交互作用。對ADCY9基因易感位點rs1967309與環境因素進行交互作用分析，結果提示rs1967309 位點與變應原接觸間存在交互作用，經logistic 回歸分析顯示該交互作用增加了哮喘發生的風險，提示rs1967309 位點與變應原接觸產生了協同作用。

綜上，ADCY9基因rs1967309是兒童哮喘的易感位點，該位點和變應原接觸的交互具有協同致哮喘的作用。rs2230739、rs2601814、rs2601825、rs2601796和rs2283497位點并非兒童哮喘的易感位點。由于不同地區、種族差異和樣本量大小問題導致同一疾病的發病的易感基因不同，并不能完全闡述ADCY9基因多態性與兒童哮喘的關系，需進一步深入研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。