醬香型白酒對小鼠慢性酒精性肝損傷的影響效應(yīng)

盧君，皇甫潔，劉雅，李長文，王凡，唐平，畢榮宇，王德良

1(貴州國臺酒業(yè)集團股份有限公司，貴州 仁懷，564500)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)3(酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京，100015)4(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)

隨著近幾年我國酒精類飲品的消耗不斷增加，酒精產(chǎn)生的健康性問題日益突出。酒精性肝病是長期過量飲酒導(dǎo)致的酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化及酒精性肝硬化的統(tǒng)稱，目前我國酒精性肝病呈現(xiàn)迅速增長趨勢[1]。

白酒是中國的國酒。隨著我國國民經(jīng)濟的不斷發(fā)展和人民生活質(zhì)量的提高，人們對健康白酒的需求量日益增加。醬香型白酒作為中國白酒典型香型之一，因其獨特的工藝，幽雅細膩的口感，含有多種有益健康的成分，以及較好的飲后舒適度，備受消費者的喜愛[2]。

近年來，多有針對醬香型白酒健康飲用功效的研究報道。陳蕊等[3]觀察兩種不同品質(zhì)的白酒長期灌胃后對大鼠肝臟的病理學(xué)影響，發(fā)現(xiàn)優(yōu)級白酒致肝臟損傷程度較一般白酒小。王川南等[4]通過將不同劑量的醬香型白酒對小鼠連續(xù)灌胃，結(jié)果表明低、中劑量的白酒對小鼠基本無肝損傷影響，甚至低劑量白酒對小鼠抗疲勞有一定的效果。趙雪珂等[5]通過觀察高、中、低不同劑量的某醬香型白酒對酒精代謝相關(guān)酶表達的影響，來探討醬香型白酒進入體內(nèi)后代謝情況，研究結(jié)果表明該醬香型白酒對大鼠肝臟乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)的影響與純食用酒精無顯著差異，但可明顯升高大鼠肝臟乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)活性，從而減輕乙醛對機體的毒害作用。羅強等[6]通過建立氧化損傷模型，證實了從醬香型白酒中分離出的活性成分對肝組織中相關(guān)氧化酶抗氧化基因表達有促進作用。

本實驗旨在通過小鼠慢性酒精性肝損傷模型，對比分析長期飲用醬香型白酒與其他香型白酒后對酒精性肝損傷的影響差異性，并初步探討其酒體微量成分的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗酒樣

實驗組樣品：A、B、C、D為本公司生產(chǎn)的4款醬香型白酒產(chǎn)品(分別標記GT-GB、GT-JJ、GT-15、GT-LJ)，E、F、G分別為市售的某濃香型、清香型和醬香型白酒名優(yōu)代表產(chǎn)品，各個酒樣酒精度數(shù)均為53%vol。對照組樣品：分別為食用酒精(伏特加，酒精度數(shù)調(diào)整為53%vol)對照組和安慰劑(生理鹽水)對照組。

1.1.2 實驗小鼠及環(huán)境要求

小鼠品系為C57/BL21，4月齡，雄性，平均體重為(20±2) g，購于北京斯貝福生物公司，喂養(yǎng)實驗于北京卓凱生物技術(shù)公司清潔Ⅱ級環(huán)境[實驗動物使用許可信息：SYXK(京)2021-0025]。

1.1.3 實驗試劑

小鼠乙醇脫氫酶酶聯(lián)免疫試劑盒(037245)、小鼠乙醛脫氫酶酶聯(lián)免疫試劑盒(037243)，上海酶聯(lián)免疫生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoximutase，SOD)測定試劑盒(A001-1-2)、還原型谷胱(glutathione，GSH)甘肽測定試劑盒(A006-1-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)測定試劑盒(A005-1-2)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(A003-1-2)，南京建成生物工程研究所。

1.1.4 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Milli-Q Gradien超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；TE412-L精密電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Scimtific Forna 900超低溫冰箱、Multlskan FC酶標儀、Themo BR4i冷凍離心機，美國熱電公司；SpectraMax?iD3多功能酶標儀，美國Molecular Devices 公司；DHG-9 162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；KIMBLE Dounce組織研磨儀，德國sigma公司。

1.2 動物喂養(yǎng)與樣品采集

1.2.1 動物分組與處理

45只小鼠隨機分為9組，每組5只。

根據(jù)《2019年美國肝病學(xué)會臨床指南：酒精相關(guān)性肝病的診斷和治療》[7]對酒精性肝病的人體每日酒精攝入最大劑量建議，同時結(jié)合我國飲酒人群的日常飲酒量統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)，以人體每日攝入純酒精量90 g/kg單位體重為參照，與小鼠的等效藥理學(xué)劑量折算出每只小鼠每日純酒精攝入劑量為8 g/kg單位體重，根據(jù)所用酒樣的酒精度(53%vol)，計算出每只動物每天灌胃白酒和食用酒精劑量為0.25 mL。

連續(xù)灌胃21 d進行肝損傷病理模型造模，記錄小鼠健康狀況變化。

1.2.2 樣本采集

將灌胃最后一天的小鼠禁食14 h，用乙醚輕微麻醉后，采用急性失血法頸椎脫臼處死小鼠后獲得肝臟組織樣本，置于-80 ℃超低溫冰箱貯存待測，所有操作遵循程序符合實驗動物倫理操作規(guī)范(備案號：ZKNJ-2021-011H)。

1.3 抗氧化指標測定

1.3.1 小鼠肝臟中ADH及ALDH含量測定

用4 ℃生理鹽水沖洗肝臟組織，清除血液。濾紙吸干后，稱取0.1 g肝組織，用PBS緩沖液(pH=7.2～7.4)制備10%組織勻漿，在4 ℃下以6 000 r/min離心15 min，收集上清液，按試劑盒說明書測定ADH和ALDH的含量。

1.3.2 SOD活性測定

黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。按照試劑盒的操作步驟，將每種試劑加入試管中，加入0.02 mL 10%肝組織勻漿，均勻混合，在37 ℃下溫育20 min，在450 nm處用酶標儀測量OD值。

1.3.3 GSH含量測定

比色法測定GSH含量。按照試劑盒的操作步驟，將每種試劑加入試管，加入1.0 mL 10%肝組織勻漿，在420 nm和1 cm光徑下用酶標儀測定OD值。

1.3.4 GSH-PX活性測定

比色法測定GSH-Px活性。按照試劑盒的操作步驟，將每種試劑加入試管，加入0.2 mL 10%肝組織勻漿，在412 nm處用酶標儀測定OD值。

1.3.5 MDA含量測定

硫代巴比妥酸法測定MDA含量。按照試劑盒的操作步驟，將每種試劑加入試管中，加入0.05 mL 10%肝組織勻漿，用旋渦混合器攪拌均勻，用保鮮膜固定試管口，用針頭扎1個小孔，在95 ℃下沸水浴40 min，取出冷卻，然后4 000 r/min 離心10 min，取上清液，在532 nm和1 cm光徑下，用酶標儀測量OD值。

1.4 肝臟組織病理學(xué)蘇木精伊紅染色法 (hematoxylin-eosin,HE)觀察

從肝左葉中部橫切面取材，冷凍切片，蘇丹Ⅲ進行HE染色，200倍顯微鏡下觀察。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果采用Excel 2019、SPSS Statistics 26軟件分析處理數(shù)據(jù)，圖表由Origin 2017繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟中ADH及ALDH含量分析

ADH、ALDH是酒精在肝臟氧化代謝過程中主要的代謝酶，可以將乙醇代謝為乙醛，并將乙醛分解成乙酸，參與三羧酸循環(huán)，最終生成二氧化碳和水被排出體外[8]，從而減少乙醛在體內(nèi)的蓄積。本實驗對灌胃21 d后小鼠肝組織勻漿中ADH、ALDH含量進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見圖1。與安慰劑組相比較，除了C酒樣(醬香GT-15)，其他實驗組肝組織勻漿中ADH含量增加，其中E 組(某濃香)有顯著性差異(P<0.05)，G組(某醬香)差異極顯著(P<0.01)。與食用酒精組相比較，除G組(某醬香)外，其他灌胃組小鼠肝組織勻漿ADH含量均減少，其中醬香GT樣品B、C、D組差異顯著(P<0.05)。分析肝組織勻漿中的ALDH含量，僅有A(醬香GT-GB)、C酒樣(醬香GT-15)與安慰劑和食用酒精(伏特加)組相比有增加，但差異不顯著。肝臟ADH表達水平提高說明該酒長期飲用可以促進對肝臟酒精的敏感性，提升酒精代謝轉(zhuǎn)化為乙醛速率，但是如果乙醛脫氫酶表達水平并未提升，反而增加了乙醛積累量產(chǎn)生毒性。

a-肝臟ADH含量；b-肝臟ALDH含量圖1 長期灌胃不同白酒樣品小鼠肝臟中ADH、ALDH含量Fig.1 Analyzing the content of ADH、ALDH in mice liver after Baijiu chronic administration注：*表示與安慰劑組相比較有顯著性差異(P<0.05)，**表示與安慰劑組相比較有極顯著性差異(P<0.01)；#表示與食用酒精組相比較有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 肝臟中SOD、GSH、GSH-Px含量分析

SOD在氧化和抗氧化的平衡中起著重要作用，可以降解并清除機體內(nèi)活性氧自由基。GSH-Px是機體重要的抗氧化酶，能催化H2O2的分解，降低機體內(nèi)羥自由基的水平，從而保護生物膜。GSH是一種重要的抗氧化劑和自由基清除劑，具有較強的還原作用，使肝細胞膜對氧自由基的耐受作用增強從而保護肝細胞。此外，肝細胞GSH的一個非常重要的生理功能是整合解毒功能，能與某些藥物和毒素結(jié)合，參與生物轉(zhuǎn)化，將體內(nèi)有害毒物轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)并排出體外[9-10]。因此，分析酒精造模動物肝臟中SOD、GSH、GSH-Px的表達水平變化情況，可以清晰判斷酒精性肝損傷的影響程度。連續(xù)長期灌胃不同酒樣的小鼠肝組織勻漿中SOD活力、GSH含量和GSH-Px活力檢測結(jié)果如圖2所示。各灌胃酒樣的實驗組小鼠肝臟中SOD活力與灌胃安慰劑組相比較，均有所提升，但在統(tǒng)計學(xué)上僅有E酒樣(某濃香白酒)有顯著差異(P<0.05)。與灌胃食用酒精組相比較，各酒樣灌胃組均無顯著差異(P>0.05)。灌胃醬香GT酒樣A、B、C、D組的小鼠肝臟SOD活力與灌胃酒樣E(某濃香白酒)、F組(某醬香白酒)相比較有所升高，并無顯著性差異。分析各灌胃酒樣后小鼠肝組織勻漿中GSH-Px、GSH含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與灌胃安慰劑相比較，除G酒樣(某醬香白酒)外，其余各酒樣組小鼠肝組織勻漿中GSH-Px活力均有所增加，其中A(醬香GT-GB)、F(某清香白酒)組差異極顯著(P<0.01)；各灌胃組小鼠肝組織勻漿中GSH含量均增加，其中A(醬香GT-GB)、E(某濃香白酒)、F(某清香白酒)、G組(某醬香白酒)有顯著性差異(P<0.05)。相對酒樣A組(醬香GT-GB)，灌胃醬香GT其他酒樣B、C、D組小鼠肝組織勻漿中GSH含量顯著下降(P<0.01)，GSH-Px活力顯著降低(P<0.05)。與灌胃G酒樣(某醬香白酒)相比較，灌胃醬香GT酒樣B、C、D酒樣模型組小鼠肝臟GSH含量極顯著性升高(P<0.05)，而GSH-Px活力則極顯著性下降(P<0.01)。與E(某濃香白酒)、F組(某醬香白酒)相比較，灌胃酒樣A組(醬香GT-GB)的小鼠肝臟GSH含量及GSH-Px活力增加，差異顯著(P<0.05)，灌胃醬香GT酒樣B、C、D組小鼠肝臟GSH-Px活力明顯升高(P<0.05)。已有研究結(jié)果表明，長期灌胃醬香白酒的小鼠肝損傷程度較小，推測可能與其所含的SOD作為氧自由基清除劑有關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果表明，除醬香型白酒外，清香型白酒和濃香型白酒也能在一定程度上緩解長期酒精攝入引起的小鼠肝臟抗氧化應(yīng)激壓力，降低酒精性肝損傷水平。另外，在醬香GT 4個酒樣中，長期灌胃醬香GT-GB酒樣的小鼠肝臟GSH-PX活力和GSH含量較其他酒樣升高且差異極為顯著(P<0.01)，其他幾類醬香GT白酒也可以顯著提升小鼠肝臟GSH-Px和GSH表達水平。

a-肝臟SOD 活力;b-肝臟GSH含量;c-肝臟GSH-Px活力圖2 長期灌胃不同白酒樣品小鼠肝臟中SOD、GSH、GSH-Px含量和活力測定結(jié)果Fig.2 Analyzing the content and activity of SOD、GSH、GSH-Px liver in mice livers after Baijiu chronic administration注：##表示與食用酒精組相比較有極顯著性差異(P<0.01)(下同)

2.3 肝臟中MDA含量分析

MDA為機體脂質(zhì)過氧化的重要終產(chǎn)物，其表達水平可以反映脂質(zhì)過氧化程度[13-14]，間接反映肝細胞受損程度。如圖3所示，灌胃酒樣的實驗組與安慰劑組相比較，除B組(醬香GT-JJ)和D組(醬香GT-LJ)外，其他各組小鼠肝臟中MDA含量上升，其中A組(醬香GT-GB)、E組(某濃香白酒)具有顯著差異(P<0.05)。與食用酒精組相比較，各組灌胃酒樣的小鼠肝臟中MDA含量均有所下降，其中B組(醬香GT-JJ)、D組(醬香GT-LJ)下降水平差異極顯著(P<0.01)。醬香GT 4個酒樣中，灌胃A、C、D后小鼠肝臟中MDA含量相對灌胃酒樣B組有所增加，且A組升高較為顯著(P>0.01)。與其他樣品相比，灌胃醬香GT酒樣B、C、D后小鼠肝臟中MDA含量相對灌胃酒樣G組(某醬香白酒)有所減少，有顯著差異(P<0.05)。研究結(jié)果表明，灌胃各醬香GT白酒后的小鼠肝組織勻漿MDA含量顯著下降，酒精及其代謝產(chǎn)物形成的負面效應(yīng)程度降低，酒精性肝損傷程度降低。

圖3 長期灌胃不同白酒樣品小鼠肝臟中MDA含量測定結(jié)果Fig.3 Analyzing the content of SOD、GSH、GSH-Px in mice livers after Baijiu chronic administration

2.4 肝細胞HE染色形態(tài)學(xué)觀察

肝細胞HE染色形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果圖4所示。安慰劑組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細胞排列整齊、大小正常，胞漿均勻，無炎癥細胞浸潤，無明顯的肝組織變性、水腫、壞死等現(xiàn)象。中央靜脈內(nèi)具有紅細胞，肝匯管區(qū)的膽管上皮排列正常，門靜脈分支正常，雙核比例在正常范圍(25%)。其他各香型白酒組、各醬香白酒組小鼠肝內(nèi)血竇擴張，內(nèi)有紅細胞，肝門靜脈內(nèi)有紅細胞，極少部分樣品門靜脈分支略擴張，內(nèi)含大量紅細胞，但是未見有炎癥細胞浸潤，未見明顯肝組織變性、水腫、壞死等。

a-食用酒精組；b-安慰劑(生理鹽水)組；c-濃香型白酒組；d-醬香型白酒組；e-清香型白酒組圖4 長期灌胃不同香型白酒的小鼠肝細胞HE染色形態(tài)學(xué)觀察Fig.4 Morphometric analysis of liver cells by HE staining after Baijiu chronic administration in mice

2.5 酒體風(fēng)味成分分析

長期以來多數(shù)人認為，由于醬香白酒中富含豐富的四甲基吡嗪類活性成分可以提高細胞內(nèi)抗氧化酶活力，降低酒精代謝對肝臟組織的危害[6]。但是本實驗結(jié)果表明，并非所有醬香白酒長期飲用后都能提高肝臟細胞抗氧化水平，濃香型白酒和清香型白酒也可以增加肝臟抗氧化酶活力。而四甲基吡嗪類物質(zhì)在濃香型白酒和清香型白酒酒體中少有檢測出，推測在白酒中不是四甲基吡嗪類活性成分而是其他微量成分可以綜合降低酒精的負性影響。因此，本實驗通過定量測定所用酒樣的主要風(fēng)味骨架成分，并結(jié)合主成分分析(principal component analysis，PCA)對白酒中可能起主要作用的風(fēng)味成分進行預(yù)測，結(jié)果如表1、圖5 所示。在本實驗所用濃香型白酒中，己酸、丁酸、己酸乙酯和丁酸乙酯起主要作用；在清香型白酒中，乙酸等有機酸、葵酸乙酯、月桂酸乙酯等酯類成分起主要作用；醇類和醛類成分在清香型和濃香型白酒樣品中作用并不顯著；在醬香型白酒中，酸類、醛類、醇類和大部分酯類成分起主要作用。

表1 白酒樣品中主要風(fēng)味物質(zhì)含量 單位：mg/LTable 1 Contents of main flavor compounds in Baijiu samples

續(xù)表1

酸在醬香白酒中有呈香和呈味的雙重功效，同時又能起到調(diào)味解暴的作用，還是生成酯類的前驅(qū)物質(zhì)，是醬香型白酒不可缺少的微量物質(zhì)。有研究表明，白酒中乙酸、庚酸、辛酸等有機酸可以抑制膽固醇的合成，乳酸可以抑制吲哚、酚等有害物質(zhì)生成，有效防止細胞老化，有一定的殺菌作用，酒石酸具有一定的消炎抗病毒的作用，亞麻酸等人體所必須的脂肪酸具有加快新陳代謝與興奮中樞神經(jīng)的作用，可以預(yù)防氧化應(yīng)激、增加抗氧化能力[6]。近幾年有研究人員利用小鼠模型探究白酒關(guān)鍵微量成分對醉度的影響，發(fā)現(xiàn)乙酸可以起到減弱白酒的醉酒度，而多元醇類成分可以增加白酒醉酒度[15]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醬香白酒總酸含量均高于濃香樣品和清香樣品，醬香GT的4個樣品總酸含量高于另一個對照醬香型白酒樣品，具體體現(xiàn)在乙酸、丙酸、甲酸、正丁酸、己酸和硫酸根離子的含量上，但是正丙醇、乙醛乙酯和主要醛類物質(zhì)含量均高于對照醬香型白酒樣品，推測有機酸成分可以緩解白酒中酒精、雜醇等醛類物質(zhì)的負性影響。后期可重點探討白酒中有機酸成分對降低酒精負性影響的協(xié)同增效機制。

a-醇類;b-醛類;c-酸類;d-酯類圖5 白酒樣品中四類骨架風(fēng)味成分PCAFig.5 Projection plot of principal component analysis of the main flavor in Baijiu

3 結(jié)論與討論

在飲酒數(shù)分鐘內(nèi)，純食用酒精(乙醇)即可通過胃腸吸收進入肝臟，使肝細胞受損，飲酒量越大，對肝臟的損傷越大。長期大量飲酒的負性作用較為顯著，能使肝臟中過氧化物明顯升高，而抗氧化物質(zhì)SOD、GSH活性下降，內(nèi)源性抗氧化能力減弱，清除自由基的能力下降，肝細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，從而導(dǎo)致酒精性肝損傷的發(fā)生。

與國外蒸餾酒相比，中國白酒傳統(tǒng)釀造工藝采集了窖池、多糧、環(huán)境多維微生物、固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾、后期貯存等一系列策略，形成了具有豐富風(fēng)味微量成分、風(fēng)格飽滿、氣味和諧統(tǒng)一的酒體。醬香型白酒因為具有高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、生產(chǎn)周期長的特點，所以其風(fēng)味構(gòu)成龐雜豐富[16]。關(guān)于飲用醬香型白酒健康功效的研究在國內(nèi)外期刊上多有報道[17]，而且大部分研究對象都是茅臺酒，但是中國醬香型白酒不光是茅臺一支獨秀。另外，關(guān)于中國各香型白酒的對于酒精性肝損傷的對比研究結(jié)果也不盡相同。特別值得一提的是，酒類生產(chǎn)企業(yè)不切實際的夸大了吡嗪類等含量極低的生物活性成分在白酒中的健康作用，不但誤導(dǎo)消費者對于白酒的非理性消費，而且在酒體設(shè)計和品質(zhì)提升上刻意強調(diào)了提升某一類功能性健康成分的工藝改進措施，反而忽視了對于醇醛酸酯這幾大類主要微量骨架風(fēng)味成分的平衡優(yōu)化作用。

本實驗通過小鼠慢性酒精性肝損傷模型研究，首次系統(tǒng)分析了長期灌胃醬香型白酒、濃香型白酒和清香型白酒的一些產(chǎn)品以及食用酒精(伏特加)對酒精性肝損傷的影響程度。研究結(jié)果表明，相對于純食用酒精(伏特加)，中國白酒無論是醬香型白酒、濃香型白酒和清香型白酒，長期灌胃小鼠后，均可以在一定程度上增加小鼠肝臟抗氧化酶活力，減弱由氧自由基堆積引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低酒精對肝臟的損害作用。在有機酸含量和種類水平上具有相對優(yōu)勢的醬香型白酒，肝臟產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)SOD、GSH含量上升，而脂質(zhì)過氧化的重要終產(chǎn)物MDA含量較低，推測醬香型白酒中通過自然發(fā)酵形成的較高含量的有機酸成分可以通過協(xié)同增效機制有效緩解酒精性肝病發(fā)生。本實驗研究結(jié)果可為醬香型白酒消費者端品質(zhì)表達以及高舒適度的酒體設(shè)計提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。