牛樟樹提取物促進樟芝深層發酵無性產孢及其應用

李華祥，石瑀，羅志珊，高亞軍，王娟娟，肖玉娟，袁磊，饒勝其，楊振泉*

1(揚州大學 食品科學與工程學院，江蘇 揚州，225127)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)3(廈門華廈學院 環境與公共健康學院，福建 廈門，361024)

牛樟樹(CinnamomumkanehiraeHay)屬于樟目、樟科、樟屬(Cinnamomum)，是一種常綠闊葉喬木，也是我國臺灣地區特有的樹種，同時也是樟芝的唯一天然宿主[1-2]。樟芝(Antrodiacamphorata，Antrodiacinnamomea或Taiwanofunguscamphoratus)，又名牛樟芝或牛樟菇，是一種食藥兩用真菌，屬于擔子菌門(Basidiomycota)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)，具有解酒、保肝、抗炎、抗癌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、緩解疲勞、調節免疫等多種生物活性[3-6]，已成為目前食藥用菌研究領域的熱點之一。出眾的生物活性使樟芝有著極大的市場需求，但野生樟芝子實體數量稀少、價格昂貴[7]。因此，大規模人工培養牛樟芝顯得尤為必要。其中，深層發酵技術由于具有周期短、效率高、成本低、易于規模化生產等優點，已成為目前樟芝最主要的人工培養方式[8-10]。本文作者攻讀博士學位期間所在課題組首次報道了樟芝在深層發酵過程中會產生無性節孢子的現象，并優化了其產孢條件[11]。隨后，又發現以樟芝無性節孢子作為接種物進行深層發酵，可有效縮短樟芝發酵周期，提高發酵過程可控性及活性物質生產效率，并依此建立了基于無性孢子接種的樟芝快速發酵工藝[12-13]。

但是，樟芝深層發酵工藝在生產過程中仍然存在一些問題，如作為種子的樟芝無性孢子產量較低，導致種子制備時間長、成本高，限制了樟芝深層發酵工業生產效率[7,14]。此外，樟芝活性物質產量低也是樟芝深層發酵生產效益的主要限制因素[14]。因此，提高樟芝深層發酵產孢量及活性物質產量，是進一步提高樟芝深層發酵工業化生產效率、降低生產成本的關鍵所在。目前，提高樟芝深層發酵產孢量及活性物質產量的方法主要是優化發酵條件(包括培養基組成及發酵工藝)及添加外源物質[7]。如GENG等[11]以產孢量為檢測指標，通過優化培養基中的碳源、氮源及碳氮比，明確了樟芝只有在營養匱乏的高碳氮比培養基中才能大量產孢，而在營養豐富的低碳氮比培養基中幾乎不產孢；LU等[12]以總三萜產量為檢測指標，通過優化培養基中碳源和氮源的種類及含量，發現樟芝在營養匱乏的培養基中不適于積累活性物質。隨后，LI等[14]在綜合考慮產孢及產活性物質的前體下，通過進一步優化培養基配方及發酵工藝，建立了一種基于無性孢子接種的樟芝深層循環發酵工藝，顯著縮短了生產周期，提高了樟芝深層發酵活性物質的生產效率。

此外SHEN等[15]研究了在培養基中添加牛樟、沉水樟及香樟等不同樟樹水提物對樟芝胞內多糖抗炎活性的影響，結果發現添加沉水樟(Cinnamomummicranthum)、土肉桂(Cinnamomumosmophloeum)及蘭嶼肉桂(Cinnamomumkotoense)水提物可增加樟芝胞內多糖的抗炎活性；CHANG等[16]研究了在培養基中添加牛樟樹精油、香樟樹精油、香杉精油及紅檜精油對牛樟芝菌絲體生長及子實體形成的影響，發現牛樟樹精油能夠有效地促進牛樟芝菌絲體生長；LU等[17]研究了在培養基中添加香樟樹的水提取物、甲醇提取物、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物對樟芝產三萜的影響，結果表明香樟樹水提物可促進樟芝菌絲生長，而香樟樹石油醚提取物可顯著增加樟芝總三萜產量；李一凡等[18]研究了平皿培養時在瓊脂培養基中添加生長素、細胞分裂素等植物激素及木質素對樟芝菌絲體生長的影響，發現牛樟樹粉末對樟芝菌絲體的生長有一定的促進作用，但直接添加牛樟樹粉末不利于樟芝菌絲體的分離，故此法不適用于深層發酵。

上述研究結果表明樟樹中確實含有對樟芝生長及產活性物質有利的化合物，但前人多以對樟芝菌絲生長及活性物質的影響為研究目標，所添加的物質也多為樟屬(Cinnamomum)中其他樹種的提取物。關于在深層發酵培養基中添加牛樟樹提取物對樟芝無性產孢影響的研究，目前鮮見相關報道。因此，本文首先比較了在深層發酵培養基中添加牛樟樹不同溶劑(甲醇、乙酸乙酯、石油醚及水)提取物對樟芝無性產孢的影響，明確能顯著促進樟芝無性產孢的牛樟樹提取物組分，再考察該提取物對樟芝生長及產活性物質的影響，最終獲得既能顯著促進樟芝產孢，又能促進樟芝活性物質積累的牛樟樹提取物，為提高樟芝深層發酵種子制備效率及工業化生產效益提供理論依據并奠定實踐基礎，具有較大的開發價值及良好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟芝(Antrodiacamphorate)菌株購自“美國菌種保藏中心”(American Type Culture Collection，ATCC)，編號為ATCC 200183，由江南大學生物工程學院許正宏教授惠贈，現保存于揚州大學食品科學與工程學院食品微生物應用與控制實驗室；牛樟樹木屑(50年以上樹齡)，福建皓天生物科技有限公司；PDA培養基，生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖、酵母粉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、鹽酸等常規試劑，國藥集團化學試劑有限公司，純度均為分析純。

R404A高速冷凍離心機、移液槍/槍頭，Eppendorf(德國)；DHZ-DA 型恒溫搖床，太倉市實驗設備廠；MS-100恒溫金屬浴，杭州奧盛有限公司；pH計，廈門開普瑞生物科技有限公司；真空冷凍干燥機(2.5 L)，LABCONACO(美國)；SW-CJ-2F超凈工作臺，蘇州華宇；LV150 N光學顯微鏡，日本尼康；MDF-U5386S超低溫冰箱/普通冰箱，SANYO(日本)。

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基

本文所用斜面培養基為商用PDA培養基。

1.2.2 種子培養基[19]

葡萄糖20 g/L，酵母粉1 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，pH 4.5，121 ℃滅菌20 min后，冷卻備用。

1.2.3 發酵培養基[19]

葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，pH 4.5，121 ℃滅菌20 min后，冷卻備用。

1.3 牛樟樹提取物的制備

1.3.1 有機溶劑提取物

參照文獻[20]的方法并稍作修改。稱取20 g樣品，按料液比1∶20(g∶mL)分別加入甲醇、乙酸乙酯或石油醚，超聲30 min后，振蕩提取3 h，用4層紗布過濾并收集濾液。重復上述提取操作3次，將濾液合并后蒸干并稱重。所得干物質用適量體積的去離子水復溶，使得提取物最終質量濃度為50 mg/mL(母液)，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 水提取物

參照文獻[20]的方法并稍作修改。稱取20 g樣品，按料液比1∶20(g∶mL)加入去離子水，90 ℃水浴提取3 h，用4層紗布過濾并收集濾液。重復上述提取操作3次，將濾液合并后濃縮烘干并稱重。所得干物質用適量體積的去離子水復溶，使得提取物最終質量濃度為50 mg/mL(母液)，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.4 樟芝種子制備

1.4.1 原代種子制備

用接種鏟將培養好的樟芝斜面菌絲體接種到發酵培養基中并用轉子通過磁力攪拌打碎，26 ℃、150 r/min振蕩培養12～14 d后，發酵液用4層無菌紗布過濾，濾液即為孢子懸浮液，即樟芝原代種子。

1.4.2 發酵種子制備

將原代種子按1.0×106個/mL的接種量接入種子培養基中，26 ℃、150 r/min振蕩培養10 d后，發酵液用4層無菌紗布過濾，所得濾液即為樟芝發酵種子，可用于樟芝發酵生產接種或種子制備發酵接種。

1.5 樟芝搖瓶發酵培養

將樟芝發酵種子按1.0×106個/mL的接種量接入發酵培養基中，26 ℃、150 r/min振蕩培養10～12 d。

1.6 牛樟樹提取物的添加

將1.3中配制好的牛樟樹提取物母液用直徑0.45 μm的微孔濾膜過濾除菌后，根據所需添加濃度吸取相應體積的牛樟樹提取物加入滅菌冷卻后的種子培養基中，搖勻，再按1.4.2中的方法進行接種及發酵培養即可。以添加相同體積去離子水為對照組。

1.7 檢測方法

1.7.1 生物量的檢測

將發酵培養物用4層紗布過濾，收集濾渣，75 ℃烘干至恒重，稱重并計算生物量。

1.7.2 孢子數的檢測

將發酵培養物用4層紗布過濾，收集濾液，吸取50 μm濾液并用血球計數板在顯微鏡下計數，并計算產孢量。

1.7.3 胞內多糖的檢測

按照文獻[19]的方法采用稱重法測定樟芝胞內多糖含量。即準確稱取干燥并粉碎后的菌粉2 g于10 mL比色管中，加10 mL去離子水，95 ℃水浴提取1 h，重復提取3次，將上清液轉移至50 mL離心管中，濃縮至10 mL后加30 mL無水乙醇4 ℃靜置過夜，8 000 r/min，離心10 min，將沉淀75 ℃烘干后稱重，即為粗多糖的質量。

1.7.4 總三萜含量的檢測

按照文獻[19]的方法采用香草醛-高氯酸法測定樟芝菌絲體中總三萜含量。即先以齊墩果酸為標準品繪制標準曲線。再精確稱取干燥并粉碎后的菌粉100 mg于2 mL EP管中，加入1 mL甲醇，50 Hz超聲30 min后振蕩提取1 h，8 000 r/min離心10 min后，吸取上清液100 μL于10 mL具塞試管中，水浴蒸干，加0.3 mL現配制的質量濃度為50 g/L的香草醛-冰醋酸溶液和1 mL的高氯酸，60 ℃反應20 min，冰水冷卻，加10 mL冰醋酸，搖勻，在550 nm下測定吸光度，根據標準曲線計算總三萜的含量。

1.8 數據統計及分析

本文所有實驗組均設置至少3個生物重復，所有數據均采用“平均值±標準差”的形式展示，用Origin Pro 8.0軟件進行繪圖，用SPSS PASW Statistics 18.0軟件進行差異顯著性分析，差異顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同牛樟樹提取物對樟芝深層發酵無性產孢的影響

為了考察不同牛樟樹提物對樟芝深層發酵無性產孢的影響，我們按1.6中的方法在發酵培養基中分別添加終質量濃度為50 μg/mL的牛樟樹甲醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物及水提物，并從發酵第6天開始每天取樣測定產孢量，以不添加任何牛樟樹提取物組為空白對照，結果如圖1所示。

圖1 不同牛樟樹提取物對樟芝深層發酵無性產孢的影響Fig.1 Effects of different extracts of Cinnamomum kanehirae Hay on sporulation in Antrodia cinnamomea注：“CK”表示空白對照，即不添加任何牛樟樹提取物(下同)；所有牛樟樹提取物的添加質量濃度均為50 μg/mL

由圖1可知，4種牛樟樹提取物中，只有牛樟樹水提物對樟芝無性產孢有顯著促進作用，并使樟芝深層發酵最大產孢量較對照提高了41.2%；而牛樟樹有機溶劑(甲醇、乙酸乙酯、石油醚)提取物對樟芝無性產孢則表現為明顯抑制作用，其中尤以牛樟樹石油醚提取物的抑制作用最為突出。因此，我們選擇牛樟樹水提物作進一步研究。

2.2 不同濃度牛樟樹水提物對樟芝深層發酵無性產孢的影響

接下來，我們以產孢量為檢測指標，對牛樟樹水提物添加質量濃度在20～100 μg/mL進行了優化，結果如圖2和圖3所示。

由圖2可知，牛樟樹水提物對樟芝深層發酵產孢的影響呈濃度依賴性，且最佳添加質量濃度為60 μg/mL；當添加質量濃度低于60 μg/mL時，牛樟樹水提物對樟芝產孢的促進效果隨濃度的增加而增加；當添加質量濃度高于60 μg/mL時，牛樟樹水提物對樟芝產孢的促進效果隨濃度的增加而減少；在發酵培養基中添加終質量濃度為60 μg/mL的牛樟樹水提物時，樟芝最大產孢量可達76.26×106個/mL，較不添加牛樟樹水提物的對照組提高了58%，效果非常顯著。由圖3可知，在培養基中添加最終質量濃度為60 μg/mL的牛樟樹水提物發酵所產生樟芝孢子與不添加牛樟樹水提物的對照組相比，在形態上并無顯著差異，但產孢量(孢子濃度)明顯增加。

圖2 不同濃度的牛樟樹水提物對樟芝深層發酵無性產孢的影響Fig.2 Effects of different concentrations of water extract of Cinnamomum kanehirae Hay on sporulation for Antrodia cinnamomea in submerged fermentatioin

a-CK；b-60 μg/mL圖3 樟芝深層發酵所產無性孢子Fig.3 The asexual spore of Antrodia cinnamomea from submerged fermentatioin注：圖中均為發酵原液稀釋4倍后，放大640倍(16×40)的光學顯微鏡照片

此外，從圖2的結果還可以看出，在此發酵條件下，所有實驗組產孢量均在發酵10 d時達到最大值。由于本研究的主要目的是提高樟芝深層發酵的種子制備效率，即為了獲取樟芝無性孢子。因此，選擇在產孢量達到最大值時結束發酵并收集孢子最為合理，故后續相關的生物量、胞內多糖產量及總三萜產量等指標，我們均采用發酵10 d的樟芝菌絲體樣品進行測定。

2.3 添加牛樟樹水提物對樟芝深層發酵產活性物質的影響

為了明確牛樟樹水提物除了促進樟芝無性產孢以外，對樟芝的生長及活性物質積累是否也有影響，我們對在培養基中添加了終質量濃度為60 μg/mL牛樟樹水提物且發酵10 d的樟芝菌絲體樣品的生物量、胞內多糖產量及總三萜產量進行了檢測，結果如表1所示。

表1 牛樟樹水提物對樟芝深層發酵產活性物質的影響Table 1 Effect of water extract of Cinnamomum kanehirae Hay on producing bioactive substances in Antrodia cinnamomea

由表1可知，添加牛樟樹水提物能顯著促進樟芝生長及產活性物質。其中，生物量由4.89 g/L增加到6.18 g/L，提高了26%左右；總三萜產量由25.18 mg/L增加至34.65 mg/L，提高了35%左右。但促進效果最為顯著的胞內多糖。添加牛樟樹水提物后，樟芝菌絲體中的胞內多糖質量分數由11.17%增加至33.51%，提高了200%以上；胞內多糖產量則由546.22 mg/L增加至2 070.92 mg/L，提高了270%左右，產量是原來的3.7倍。可見，牛樟樹水提物除了能顯著促進樟芝無性產孢以外，還能顯著促進樟芝菌絲體生長及活性物質的積累，可謂一舉多得。

2.4 牛樟樹水提物促產孢子的發酵性能研究

為了進一步確定牛樟樹水提物促進樟芝無性產孢的應用價值，我們將添加牛樟樹水提物(60 μg/mL)促進產生的樟芝無性孢子(以下簡稱“促產孢子”)與相同條件下不添加牛樟樹水提物發酵產生的樟芝無性孢子(以下簡稱“對照孢子”)的發酵性能(包括產孢性能和產活性物質性能)進行比較，以明確牛樟樹水是否會對樟芝孢子的種子活力產生負面影響。

首先，我們將“促產孢子”與“對照孢子”按1.0×106個/mL的接種量接入種子培養基中，26 ℃、150 r/min振蕩培養12 d。期間，從第6天開始，每天取樣進行孢子計數，以考察“促產孢子”與“對照孢子”的產孢性能，結果如圖4所示。

圖4 牛樟樹水提物促進產生的樟芝無性孢子深層發酵的產孢性能Fig.4 Sporulation performance of Antrodia cinnamomea spores induced by water extract of Cinnamomum kanehirae Hay注：“促產孢子”表示在種子培養基中添加最終質量濃度為60 μg/mL的牛樟樹水提物，按1.0×106 個/mL的接種量接入樟芝原代孢子，26 ℃、150 r/min培養10 d后，所產生收集的樟芝無性孢子；“對照孢子”表示將樟芝原代種子按1.0×106 個/mL的接種量接入種子培養基中，26 ℃、150 r/min培養10 d后，所產生收集的樟芝無性孢子

由圖4可知，“促產孢子”的產孢速度及最大產孢量均顯著高于“對照孢子”，其最大產孢量65.63×106個/mL較“對照孢子”的50.88×106個/mL提高了28%左右。此結果說明樟芝“促產孢子”在深層發酵中的產孢性能顯著優于“對照孢子”。

此外，我們還將“促產孢子”與“對照孢子”按1.0×106個/mL的接種量接入發酵培養基中，26 ℃、150 r/min 培養。由之前的研究結果[19]可知，本文所用樟芝菌株在該條件下發酵時，樟芝胞內多糖及總三萜等活性物質質量分數均在發酵10 d時達到最大值，因此，選擇在第10天時結束發酵，并對樣品的生物量、胞內多糖產量及總三萜產量進行測定，結果如表2所示。

表2 牛樟樹水提物促進產生的樟芝無性孢子深層發酵的產活性物質性能Table 2 Bioactive substances production performance of Antrodia cinnamomea spores induced by water extract of Cinnamomum kanehirae Hay in submerged fermentatioin

由表2可知，樟芝“促產孢子”發酵產生的生物量及總三萜產量與“對照孢子”相比無顯著差異；但“促產孢子”發酵的樟芝菌絲體中的胞內多糖質量分數及胞內多糖產量較“對照孢子”提高了39%和46%左右，分別為20.51%和1 432.84 mg/L。上述結果表明樟芝“促產孢子”在深層發酵中的生長及產三萜性能與“對照孢子”無顯著差異，但“促產孢子”在深層發酵中產胞內多糖的性能顯著優于“對照孢子”。

綜上所述，樟芝“促產孢子”在深層發酵過程中的發酵性能要顯著優于“對照孢子”，優勢主要體現在產孢性能及產胞內多糖性能上，究其原因及機理，尚有待于進一步研究。

本研究結果較具實際意義及應用價值。因為通常情況下，樟芝產孢和產多糖的最適條件是不一致的：營養匱乏的培養基更適合樟芝產孢，營養豐富的培養基更適合樟芝產多糖[11-12]。因此，人們通常根據發酵目的不同而采用不同的培養基配方。即，制備種子(樟芝無性孢子)時采用營養較為匱乏的培養基，如本文所使用的“種子培養基”，碳氮比約為20∶1；發酵生產時通常采用營養較為豐富的培養基，如本文所使用的“發酵培養基”，碳氮比約為2∶1。但樟芝在營養匱乏的種子培養基中，生物量及三萜、多糖等活性物質含量通常較低[19]。因此，在制備樟芝種子的發酵過程中，收集完孢子后剩下的樟芝菌絲體通常顯得很“雞肋”，直接丟棄比較可惜，但用來提取活性物質又因為產量太低、提取成本太高而受到限制。本研究結果很好地解決了這個“雞肋”問題，只需在種子培養基中添加微量(60 μg/mL)的牛樟樹水提物，便可在顯著提高樟芝孢子產量的同時，使得樟芝胞內多糖產量也提高至原來的3.7倍，效果極其顯著。

3 結論

本文首先比較了牛樟樹4種溶劑(甲醇、石油醚、乙酸乙酯、水)提取物對樟芝深層發酵無性產孢的影響，結果發現只有牛樟樹水提物對樟芝產孢呈現出顯著促進作用；隨后，我們對牛樟樹水提物的添加濃度進行了優化，發現其最佳添加質量濃度為60 μg/mL；在最佳添加濃度下，牛樟樹水提物可使樟芝深層發酵產孢量較對照提高58%左右，同時生物量提高26%左右，三萜產量提高35%左右，多糖產量則提高270%左右；最后，本文對添加牛樟樹水提物促進產生的樟芝孢子(簡稱“促產孢子”)的發酵性能進行了研究，發現“促產孢子”在產孢性能及產胞內多糖性能方面均顯著優于不添加牛樟樹水提物發酵產生的樟芝孢子，其中最大產孢量及胞內多糖產量較對照分別提高了28%及46%左右。本研究結果解決了制備樟芝孢子時所產生樟芝菌絲體的“雞肋”問題，同時也顯著提高了樟芝深層發酵生產的效益，可謂變廢為寶，一舉多得。此外，本研究成果操作方便、成本低廉、材料來源廣泛，容易推廣及規模化，具有較大開發價值及良好的應用前景。