Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變純合小鼠模型的構建

王孟軻， 劉守勝， 褚雪汝， 王藝奮， 辛永寧

1 青島大學附屬青島市市立醫院 a.感染性疾病科， b.臨床研究中心， 山東 青島 266071；2 中國海洋大學 醫藥學院， 山東 青島 266071

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的、以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征[1-3]。有研究[4-6]發現NAFLD與胰島素抵抗和遺傳易感性顯著相關。含patatin樣磷脂酶域3(patatin-like phospholipase domain containing 3, Pnpla3)位于22號染色體上[7], 主要表達于脂肪組織和肝臟[8]。跨膜蛋白6超家族成員2基因(transmembrane 6 superfamily member 2，Tm6sf2)位于第19號染色體上，TM6SF2主要定位于內質網膜，主要表達于肝臟和小腸[9]，這兩個器官參與全身脂質穩態的調節[10]。全基因組關聯和外顯子組測序結果顯示Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K基因的遺傳變異與NAFLD的易感性和進展相關，Pnpla3 I148M是指該蛋白第148位異亮氨酸被蛋氨酸取代，Tm6sf2 E167K是指該蛋白第167位谷氨酸被賴氨酸取代，Pnpla3和Tm6sf2基因的遺傳變異與肝脂肪含量增加、進展為非酒精性脂肪型肝炎、肝硬化和肝細胞癌密切相關[11-13]。人群研究[14-15]發現Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變對NAFLD的發展產生疊加效應，協同參與肝臟脂肪變性的發展。但是Pnpla3 I148M聯合Tm6sf2 E167K對NAFLD的共同作用及機理尚不明確，因此本研究旨在構建Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變小鼠模型，探究其在常規飲食條件下體內脂質代謝的變化，為探究Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變在NAFLD發病中的聯合作用及相關機制提供良好的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料 Tm6sf2 E167K小鼠與Pnpla3 I148M小鼠均為本課題組所有(青島大學附屬青島市市立醫院肝病研究室)，所有小鼠均飼養于SPF級動物房。實驗動物生產許可證:SCXK(蘇)2018-0008，實驗動物使用許可證: SYXK(魯)20200009。TC、TG、AST和ALT檢測試劑盒購買自南京建成生物工程研究所；血糖儀和血糖試紙購買自日本OMRON公司；胰島素檢測試劑盒購買自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的繁育策略 Pnpla3148I/M和Tm6sf2167E/K雜合小鼠通過各自自交，分別得到Pnpla3148M/M和Tm6sf2167K/K單突變純合小鼠，通過Pnpla3148M/M單突變純合小鼠與Tm6sf2167K/K單突變純合小鼠交配，得到Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K雙突變雜合小鼠，最后通過Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K雙突變雜合小鼠自交，得到Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變純合小鼠(圖1)。統計Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K雙突變雜合小鼠自交后的子代中Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠、Pnpla3148M/M單突變純合小鼠、Tm6sf2167K/K單突變純合小鼠、雜合小鼠(包括Pnpla3 I148M或Tm6sf2 E167K單突變雜合小鼠及雙突變雜合小鼠)和Wt小鼠的數量，計算各種基因型小鼠數量占總體的比例，檢驗是否符合孟德爾遺傳分離定律。

1.3 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的基因鑒定 剪取1～2周齡小鼠0.3 cm小鼠尾尖于1.5 mL EP管中，加入60 μL堿性裂解液A(A液：25 mmol/L氫氧化鈉；20 μmol/L 乙二胺四乙酸二鈉)，95 ℃金屬浴40 min后加入60 μL裂解液B(B液：40 mmol/L Tris-Cl),機械研磨3 min，6000 r/min離心6 min得到上清液即為粗提所得DNA,以其作為模板進行PCR擴增。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶大小來鑒定Tm6sf2基因型，利用基因測序方法鑒定Pnpla3基因型。Tm6sf2和Pnpla3的PCR引物見表1，Pnpla3測序引物見表2。

1.4 小鼠口服普通糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT) 選擇8周齡同窩別Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K(n=6)、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E(n=6)、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K(n=6)和Wt(n=6)雄性小鼠，提前數天給小鼠做掐尾訓練。

表2 Pnpla3小鼠基因型測序引物序列Table 2 Primer sequences for Pnpla3 mouse genotype sequencing

實驗當天于早上8點給予小鼠禁食6 h，禁食結束后稱量體質量并檢測鼠尾靜脈空腹血糖，然后給每只小鼠進行葡萄糖灌胃(2 g葡萄糖/kg體質量)[16]。分別測量灌胃后30、60、120 min時的小鼠尾靜脈血糖，記錄血糖值并制作OGTT曲線。

1.5 小鼠生化指標檢測 選擇8周齡同窩別Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K(n=6)、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E(n=6)、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K(n=6)和Wt(n=6)雄性小鼠，禁食禁水6 h后，稱量體質量，利用4%水合氯醛對小鼠進行麻醉后取血(采用乙二胺四乙酸二鈉抗凝)，2500×g，4 ℃離心20 min，取上層血漿。然后解剖出小鼠的主要組織器官進行形態學對比，并計算肝臟指數。按照說明書方法測量小鼠血漿TC、TG、AST、ALT和胰島素水平。

1.6 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠肝組織學評估 取上述8周齡雄性小鼠的肝臟，用0.9%等滲生理鹽水清洗后用4%多聚甲醛固定，脫水后用石蠟包埋并切片，分別做小鼠肝組織的HE染色和油紅O染色，光學顯微鏡觀察并拍照。

1.7 統計學方法 數據使用 GraphPad prism 8軟件處理，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的基因鑒定 取小鼠鼠尾DNA進行PCR擴增，擴增后將產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。Tm6sf2基因型的鑒定結果為：瓊脂糖凝膠電泳結果只有一條203 bp條帶則是Tm6sf2167K/K純合突變小鼠，只有一條147 bp條帶則是Tm6sf2167E/E野生小鼠，同時擴增出上述兩條條帶則是Tm6sf2167E/K雜合小鼠。Pnpla3基因型的鑒定結果為：瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增出506 bp條帶后進行基因測序，測序結果證實第444位密碼子由ATT突變為ATG，為Pnpla3148M/M小鼠，若同時存在ATT和ATG兩種堿基類型，則為Pnpla3148I/M小鼠(圖2)。

2.2 孟德爾遺傳分離定律檢測 將Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K小鼠進行自交，統計子代Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K、雜合(Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K、Pnpla3148I/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167E/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/K和 Pnpla3148I/MTm6sf2167K/K)和Wt小鼠的數量，結果見表3，各種基因型小鼠數量總體比例大致為1∶1∶1∶12∶1，符合孟德爾遺傳分離定律，并且子代小鼠生長狀況正常，無死亡。這些結果說明Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K雙突變小鼠能夠進行正常繁育后代，并且后代可以正常存活。

2.3 不同基因型小鼠體質量和肝指數的差異檢測 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt小鼠以普通飲食喂養8周，檢測不同基因型小鼠的體質量變化。結果顯示，Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K基因型小鼠與其他三種基因型小鼠體質量無明顯差異(P值均>0.05)，檢測小鼠肝濕重發現Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠高于Wt小鼠的肝濕重(P<0.05)，但通過計算各組小鼠的肝指數發現，Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K基因型小鼠的肝指數與其他三種基因型小鼠的肝指數比較，差異無統計學意義(P值均>0.05)(圖3)。

注：a，Tm6sf2 E167K突變小鼠基因型鑒定電泳結果；b，Pnpla3 I148M突變小鼠基因型鑒定電泳結果；c、d和e為Pnpla3 I148M突變小鼠 基因型鑒定測序結果(c，Pnpla3148M/M；d，Pnpla3148I/M；e，Pnpla3148I/I)。圖2 Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K突變小鼠基因型鑒定和測序結果Figure 2 Genotype identification and sequencing results of Pnpla3 I148M and Tm6sf2 E167K mutant mice

表3 Pnpla3148I/M Tm6sf2167E/K小鼠自交后子代各基因型數量Table 3 Number of progenies with each genotype afterPnpla3148I/ MTM6SF2167E/K mice self-breeding

圖3 四種基因型小鼠在8周齡時的體質量、肝濕重和肝指數比較

2.4 不同基因型小鼠各組織的表型比較 分別解剖8周齡的Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt小鼠的腦、甲狀腺、心臟、肺、肝臟、脾臟、胃、腸、腎和睪丸，對比四組小鼠各個器官的大小和形態，發現四組小鼠之間的器官形態無明顯差異(圖4)。

2.5 不同基因型小鼠的葡萄糖代謝差異 對8周齡的Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt雄性小鼠的空腹血糖進行檢測，結果顯示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K空腹血糖低于Tm6sf2167K/K單突變小鼠和Wt小鼠，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而與Pnpla3148M/M單突變小鼠無明顯差異(P>0.05)，提示Pnpla3 I148M突變會導致小鼠空腹血糖下降。OGTT曲線下面積比較結果顯示，Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠OGTT曲線下面積較Tm6sf2167K/K單突變小鼠升高，差異有統計學意義(P<0.05)，較Pnpla3148M/M單突變小鼠和Wt小鼠無明顯差異(P值均>0.05)，提示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變較Tm6sf2167K/K單突變更容易導致小鼠葡萄糖耐受能力的下降；對四組小鼠的胰島素水平檢測結果顯示，胰島素水平在不同基因型小鼠中的水平無明顯差異(P值均>0.05)。Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的胰島素抵抗指數(HOMA-IR)較Wt小鼠有所降低，這與兩組小鼠之間的空腹血糖含量趨勢一致(圖5)。

注：a,Pnpla3148M/M Tm6sf2167K/K 基因型小鼠; b,Pnpla3148M/M Tm6sf2167E/E基因型小鼠；c,Pnpla3148I/I Tm6sf2167K/K基因型小鼠; d,Wt小鼠。

2.6 不同基因型小鼠血漿生化指標檢測 對8周齡Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt雄性小鼠的血漿TG、TC、AST和ALT水平進行檢測，結果顯示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠血漿中的TG、TC、ALT和AST水平和另外三種基因型小鼠比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)(圖6)。

2.7 不同基因型小鼠肝臟HE染色和油紅O染色結果

對8周齡Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt雄性小鼠的肝臟進行HE染色和油紅O染色，結果顯示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠與Pnpla3 I148M、Tm6sf2 E167K單突變和Wt小鼠肝組織學之間無明顯差異(圖7)；油紅O染色結果表明Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠比Pnpla3148M/M單突變小鼠和Wt小鼠肝臟內脂滴水平有所增多，提示Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變較Pnpla3 I148M單突變小鼠和Wt小鼠的肝臟更易發生脂質積累，但同Tm6sf2 E167K單突變小鼠相比無明顯差異(圖8)。

注：*P<0.05;**P<0.01。圖5 四種基因型小鼠葡萄糖耐量比較Figure 5 Comparison of glucose tolerance of micewith four genotypes

圖6 四種基因型小鼠血漿生化水平Figure 6 Plasma biochemical levels of mice withfour genotypes

注：a，Wt；b，Pnpla3148M/M Tm6sf2167E/E; c，Pnpla3148I/I Tm6sf2167K/K;d，Pnpla3148M/M Tm6sf2167K/K。圖7 四組基因型小鼠肝臟HE染色(×200)Figure 7 HE staining of liver of mice with fourgenotypes (×200)

注：a，Wt；b，Pnpla3148M/M Tm6sf2167E/E; c，Pnpla3148I/I Tm6sf2167K/K;d，Pnpla3148M/M Tm6sf2167K/K。圖8 四組基因型小鼠肝臟油紅O染色(×200)Figure 8 Oil red O staining of liver of mice with fourgenotypes (×200)

3 討論

NAFLD患病人數的逐年增加給社會帶來了沉重的醫療和經濟負擔，在全球范圍內，NAFLD的平均發病率為25%[17]。盡管目前關于NAFLD的研究已經取得了顯著進展，但是其發病機制至今尚未完全闡明。前期筆者的研究發現，Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K在細胞水平上可發揮聯合作用從而共同調節細胞內的脂質代謝過程[18]，但未在動物水平進行驗證。因此本文通過雜交繁育獲得了Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠，為進一步在動物水平探究 PNPLA3 I148M 及 TM6SF2 E167K 雙突變引發肝臟脂肪變性的作用及分子機制奠定動物模型基礎。

在本研究中，完成Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠模型構建后，對Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠的表型做了初步研究。本研究把PNPLA3 I148M 和 TM6SF2 E167K 雙突變雜合小鼠交配的后代分為Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt四組。統計Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K小鼠自交后代的存活數量，發現PNPLA3I148M和 TM6SF2 E167K 雙突變小鼠能夠正常存活，無胚胎致死情況發生。 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的體質量較其他3種基因型小鼠體質量無明顯差異，進一步對小鼠各器官形態進行觀察發現，Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠各器官形態較其他3種基因型小鼠各器官形態無明顯差異。檢測小鼠葡萄糖代謝指標，糖耐量試驗發現Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K和Pnpla3148M/M單突變小鼠空腹血糖無明顯差異，但Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的空腹血糖低于Tm6sf2167K/K單突變小鼠和Wt小鼠，提示Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變會降低小鼠的空腹血糖；OGTT曲線下面積是評價葡萄糖耐量的指標，結果顯示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠OGTT曲線下面積高于Tm6sf2167K/K單突變小鼠，表明Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠的葡萄糖耐受能力較Tm6sf2167K/K單突變小鼠有所下降。

通過對小鼠血脂和肝功指標的檢測發現，Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠血漿中TC、TG、ALT和AST與其余三種基因型小鼠無明顯差異。肝臟油紅O染色提示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變較Pnpla3148M/M單突變小鼠和Wt小鼠更容易發生肝臟的脂質積累，但Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠同Tm6sf2167K/K單突變小鼠的肝內脂滴水平無明顯差異。

本研究成功構建了Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠模型，該模型有利于在動物水平探究 Pnpla3 I148M 及 Tm6sf2 E167K 雙突變引發肝臟脂肪變性的作用及分子機制，揭示 Pnpla3 I148M 和Tm6sf2 E167K 雙突變在NAFLD發病過程中的交互作用。

倫理學聲明：實驗所用動物均按照青島大學附屬醫院醫學實驗動物倫理委員會批準的原則進行。倫理審批編號：AHQU-MAL20180504，倫理通過時間2018年5月4日。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：王孟軻進行課題設計與實施、撰寫論文；劉守勝進行課題設計、論文審閱；褚雪汝、王藝奮進行課題實施、數據收集；辛永寧進行課題設計、實驗指導和提供經費。