葡萄CBF4基因生物信息學及其對低溫和硅酸鉀響應分析

張紅梅， 王旺田， 張 芮， 楊 科， 王寶強， 王翠玲

( 甘肅農業大學 生命科學技術學院， 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室， 蘭州 730070 )

葡萄是世界最古老的落葉果樹之一，各地均有栽培，已成為重要的果樹經濟作物，種植面積和產量居世界首位，是我國的重要果樹。中國北方的葡萄由于低溫凍害使得產量減少，造成巨大的經濟損失。因此，研究葡萄的低溫響應機理，提高葡萄對低溫的適應性是十分必要的。

作為AP2/EREBP轉錄因子群的一個亞科，基因在對非生物脅迫的耐受性中發揮核心作用，植物在低溫脅迫下表現出依賴的應答通路。能夠與啟動子中的核心片段(CCGAC)相結合從而調控該基因的轉錄水平(Haake, 2002)。研究表明擬南芥1、2和3都位于Ⅳ染色體上，且緊密分布于短臂72.8 cM處，它們編碼與AP2/ERF家族密切相關的轉錄因子，這些轉錄因子與調控基因啟動子中存在的CRT/DRE DNA調控元件結合。2基因能夠負調控1 和3，從而調控下游COR等抗寒基因的表達來提高植物抗寒性(Novillo et al., 2004；呂勝男等，2011；董亞茹等，2017)。而4則位于擬南芥的Ⅴ號染色體上，是唯一已知的基因參與脫落酸(ABA)依賴的信號通路(沙麗娜，2009)。這些研究成果說明轉錄因子對植物的抗寒、抗旱和抗鹽堿等脅迫過程發揮著重要作用。研究表明，硅(Si)可以提高水稻(任學坤等，2007)、小麥(鄭世英等，2015)、高粱(劉朋等，2014)等植物的抗逆性，施加外源硅能夠提高低溫脅迫下葡萄葉片滲透調節物質含量，促進蔗糖轉運速率，緩解活性氧積累，增強耐寒性(鄭凱翔等，2019)。

目前，國內基因主要集中于擬南芥(Michael et al., 2010)、大豆(Kidokoro et al., 2014)、玉米(Zhang et al., 2010)、番茄(Yuasa et al., 2014)等植物的研究，對葡萄中基因的抗寒作用等方面研究較少，尤其對4在外源硅與低溫協同作用下的表達未見報道。本研究對4基因編碼的蛋白進行全面的生物信息學分析，對葡萄幼苗進行低溫和硅酸鉀處理，并對4基因進行實時熒光定量分析，以期為4 基因的表達特性及其功能研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 序列來源

利用NCBI數據庫獲取釀酒葡萄基因4(GenBank:DQ497624.1)。

1.2 蛋白質結構預測

1.2.1 一級結構 通過Expasy進行氨基酸殘基的數目和組成以及蛋白質的一級結構在線分析。

1.2.2 二級結構 利用SOPMA進行二級結構的預測；利用ProtScale預測蛋白的親疏水性；利用TMHMM Server v.2.0預測蛋白的跨膜結構；利用SignalP 4.0預測蛋白的信號肽。

1.2.3 磷酸化位點和糖基化位點預測 分別使用KinasePhos和NetOGlyc 4. 0預測蛋白的磷酸化和糖基化位點。

1.2.4 CBF4蛋白的細胞定位 使用PSORT Prediction 預測蛋白的細胞定位。

1.2.5 結構域預測 使用NCBI中的CDD數據庫對蛋白的結構域進行分析。

1.2.6 三級結構 通過 SWISSMODEL對葡萄4基因編碼蛋白的三維結構進行同源建模。

1.3 同源性比對及系統進化樹構建

通過NCBI在線比對，找出與該蛋白同源性較高的其他植物的氨基酸序列，再利用MEGA X軟件進行系統進化樹的構建。

1.4 低溫脅迫對葡萄組織CBF4基因的熒光定量PCR分析

以釀酒葡萄試管苗貝達為試驗材料，當植株長至5片葉時，選取長勢一致的幼苗煉苗3 d后移入裝有1/2強度Haogland營養液的水培盆(10 cm × 10 cm × 9 cm)，用泡沫板固定，在人工氣候培養箱中培養(溫度25 ℃；濕度60%；光照強度5 000 lx)60 d，營養液每2 d更換1次。外源硅處理一周后，按實驗設計分別進行常溫(25 ℃)及室內模擬低溫(5 ℃)處理，各處理過程持續光照，對照為不加硅酸鉀的葡萄水培苗，且其他條件相同。低溫處理3 h和9 h后分別取各組幼苗的中部幼嫩葉片和根部，提取RNA，反轉錄得到cDNA，以葡萄管家基因ubiquitin(AY684131.1)為內參基因對葡萄葉片和根部的4基因表達水平進行分析，根據TAKARA SYBR GREEN試劑盒說明書進行qRT-PCR反應液的配制，在定量PCR儀器上進行試驗，所有試樣重復3次，qRT-PCR生成的數據由定量分析軟件讀取，采用2法對所得數據進行分析。根據基因序列設計引物，得到引物序列如下：4(正向：5′-AAGTGGGTATGCGAGGTAAG-3′，反向：5′-TTCTGAATGTCCTTGGCG-3′)，退火溫度為60 ℃；ubiquitin(正向：5′-GGCTTGGGAGATGGGAAAC-3′，反向：5′-TCCTACAATACCACCAAACATAGCA-3′)，退火溫度為60 ℃。

1.5 數據處理

采用Origin 9和SPSS 22.0 軟件進行數據處理和分析，運用Duncan雙因素方差分析每個處理之間的差異顯著性(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 蛋白質結構分析

2.1.1 一級結構 對CBF4蛋白的理化性質分析得到葡萄CBF4蛋白的分子式為CHNOS；相對分子量為24.22 kD；理論等電點(pI)為5.42；不穩定系數為51.89，總平均親水性為-0.621，表明該蛋白為不穩定的親水性蛋白；脂肪系數為61.83，表明脂溶性比較差；正電荷殘基數(Arg+Lys)和負電荷殘基數(Asp+Glu)分別為27和34。

由表1可知，葡萄CBF4蛋白的20種氨基酸中，丙氨酸(Ala)含量最多(11.0%)，其次為精氨酸(Arg)(8.7%)與天冬氨酸(Asp)(8.3%)，氨基酸含量最小的是谷氨酸胺(Gln) (0.9%)。其中極性氨基酸占56.9%，非極性氨基酸占43.1%。

表 1 CBF4蛋白氨基酸組成分析Table 1 Analysis of amino acid compositions of CBF4 protein

2.1.2 二級結構 蛋白二級結構預測(圖1)，該蛋白二級結構主要是無規則卷曲，其次是α-螺旋，其中所占比例分別為56.88%和27.52%，延伸鏈占比為13.76%，β-轉角占比最小(1.83%)。

圖 1 CBF4基因編碼蛋白二級結構預測結果Fig. 1 Prediction results of secondary structure of CBF4 gene encoded protein

通過ProtScale分析CBF4蛋白質親/疏水性(圖2)，預測結果說明整條多肽鏈沒有明顯的疏水區域。跨膜域的預測結果(圖3)顯示，CBF4蛋白是一個膜外蛋白，沒有發現跨膜螺旋區域，這與沒有明顯疏水區域的預測結果一致。利用SignalP 4.0在線工具預測分析信號肽，對于CBF4蛋白，總結分析得到預測的目的蛋白中不存在信號肽(圖4)。

圖 2 CBF4蛋白親疏水性分析Fig. 2 Analysis of affinity and hydrophobicity of CBF4 protein

圖 3 CBF4蛋白質跨膜區結果Fig. 3 Results of CBF4 protein transmembrane region

圖 4 CBF4蛋白信號肽結果Fig. 4 Results of CBF4 protein signal peptides

2.1.3 磷酸化位點和糖基化位點預測 分別通過KinasePhos和NetOGlyc 4.0預測葡萄CBF4蛋白的磷酸化和糖基化位點，表明該蛋白含有5個磷酸化位點(圖5)和14個糖基化位點。

圖 5 磷酸化位點預測結果Fig. 5 Results of phosphorylation site prediction

2.1.4 CBF4蛋白的細胞定位 通過PSORT Prediction預測葡萄CBF4蛋白的細胞定位，結構顯示該蛋白定位在細胞核內，因此可以推斷葡萄4基因主要在細胞核內發揮生物學作用。

2.1.5 結構域預測 應用NCBI中的 CDD 數據庫預測葡萄CBF4蛋白的保守結構域，預測結果(圖6)顯示葡萄CBF4蛋白的氨基酸序列的第57位至第115位為AP2超家族結構域，在進化上非常保守，該結構域對蛋白功能的發揮非常重要。

圖 6 結構域預測結果Fig. 6 Results of domain prediction

2.1.6 三級結構預測 通過同源建模方法構建葡萄CBF4基因蛋白的三級結構(圖7)，結果顯示該蛋白三級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲折疊形成，其預測結果和二級結構相一致。

圖 7 蛋白三級結構的預測Fig. 7 Prediction of tertiary structure of protein

2.2 CBF4蛋白進化樹構建及多序列比對分析

將葡萄4基因的序列與同一物種及其他相近物種的序列進行比對分析(圖8)，結果顯示釀酒葡萄與美洲葡萄同源性最高，為99.62%，與洋薊、短腳草、爬山虎、獼猴桃、白樺、花生、茶花、赤蘚和咖啡同源性分別為99.64%、92.78%、93.31%、85.71%、81.55%、81.23%、80.13%、78.51%和75.49%。

圖 8 多序列比對結果Fig. 8 Results of multiple sequence alignment

葡萄4基因與13種同物種和相近物種同源序列的系統進化樹如圖9所示，釀酒葡萄與美洲葡萄的關系最密切，其次是河岸葡萄、山葡萄、沙地葡萄、洋薊、爬山虎、短腳草，與獼猴桃、茶花、白樺、花生、赤蘚、咖啡關系較遠，遺傳距離也隨之增加。

圖 9 系統進化樹構建結果Fig. 9 Results of system evolution tree construction

2.3 葡萄CBF4基因在低溫脅迫下的表達

葡萄水培苗經低溫脅迫處理后，4基因的表達結果顯示，低溫脅迫下葡萄葉片4基因隨低溫處理時間延長相對表達水平顯著上調，低溫脅迫3 h和9 h的上調幅度分別為對照的1.209倍、13.812倍；施加外源硅后常溫條件下4基因表達水平上調但差異不顯著，低溫條件下4基因表達水平下調(圖10：A)。在相同處理時間內，低溫脅迫相對常溫比較，葡萄根部相對表達水平下調，3 h和9 h的下調幅度分別為對照的0.573倍和0.422倍，在常溫及低溫條件下，施硅處理較對照，4基因表達均上調(圖10：B)。

A. 葉片； B. 根部。不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。A. Leaves; B. Roots. Different small letters indicate significant differences (P<0.05).圖 10 CBF4基因在低溫脅迫下的表達分析Fig. 10 Expression analysis of CBF4 gene under low temperature stress

3 討論與結論

植物受到逆境脅迫會使植物在生長發育、形態建成、物質和能量代謝等方面發生一系列的變化。相比于傳統育種，利用生物信息學能夠快速準確地探索植物抗逆基因資源，克隆相關基因并且利用相關基因提高植物抗逆性(賈翠翠，2015)。釀酒葡萄的種植會受到冷凍、干旱和高鹽的限制，低于-20 ℃的溫度會對葡萄樹造成不可逆轉的損害，影響許多葡萄栽培種的產量，降低種植者收入，若將相關抗性基因克隆并轉入釀酒葡萄中，則可以顯著提高釀酒葡萄的產量。目前，對于轉錄因子的研究較為深入和廣泛，該轉錄因子在植物非生物脅迫方面發揮著重要作用(Feng et al., 2011；Novillo et al., 2012)。研究發現1基因在馬鈴薯中超表達，能夠增強馬鈴薯的抗寒性(Pino et al., 2008)。將歐洲越桔中的1基因在擬南芥中超表達可增強其抗寒性(Oakenfull et al., 2013)。綜上所述，基因參與了植物體低溫脅迫的響應，這與本研究結果保持一致。

通過分析可知，葡萄CBF4蛋白氨基酸組成中極性氨基酸占56.9%，非極性氨基酸占43.1%，CBF4蛋白無信號肽，是一個不穩定的、親水的、脂溶性較差的膜外蛋白，與極性氨基酸所占比例一致。采用SOPMA及SWISS-MODEL分別預測CBF4 蛋白二級結構和三級結構，表明該蛋白主要結構單元是無規則卷曲，其次是α-螺旋，其中所占比例分別為56.88%和27.52%，該結果為研究4基因及其編碼產物的結構和功能提供了更多的信息。CBF4蛋白的多序列和系統進化分析表明，釀酒葡萄與美洲葡萄的同源性最高、親緣關系最近，這種同源性一方面體現出各物種間親緣關系的遠近，另一方面也表明多個不同物種的4基因編碼產物在結構特征中比較穩定，保守性較高。通過對葡萄CBF4蛋白的結構域分析得到，葡萄4包含一個AP2/EREBP結構域，屬于AP2型DNA保守結合大家族中的CBF/DREB家族，具有該家族典型的特征，含有YRG元件和WLG基序，具有高度保守性，該結構域對編碼蛋白功能發揮著極其重要的作用，可調節植物抵御低溫和干旱相關基因的表達，推測4基因與植物逆境脅迫可能密切相關(韓志萍等，2006；邵文靖等，2020)，這說明4在葡萄的抗逆性中有著非常重要的作用，具有深入研究的價值。

低溫能夠誘導大多數植物體內的基因表達，如山葡萄在寒冷、鹽度、脫落酸和水楊酸處理下，4轉錄本積累增加(Dong et al., 2013)。在葡萄樹中，4基因通常通過冷處理誘導，低溫條件下葡萄4轉錄水平相對快速地增加，并且可以在葉片中保持很多天(Xiao et al., 2010)。本研究分析表明，發現4基因低溫脅迫3 h和9 h在葡萄葉片中表達水平顯著上調，可能是因為轉錄激活因子與CRT/DRE調控元件特異性結合，激活啟動子中目的基因表達，說明4基因可能參與了葡萄葉片響應外界冷脅迫的信號途徑，因此推測出4基因可能參與了葡萄葉片低溫脅迫的響應。低溫條件下施加硅酸鉀， 在葡萄葉片中的表達下調，而在葡萄根部表達上調，可能是因為葡萄根部對低溫和硅酸鉀交互作用比較敏感，揭示了該基因在不同的葡萄組織中對硅酸鉀的響應機制可能不同。目前，應對低溫傷害的方法中使用外源物質提高作物抗性更為簡單，并且效果顯著，為了防止葡萄受到低溫傷害，應該在根部追施硅肥，本研究進一步為施用外源硅提高葡萄抗寒性提供理論依據。

本研究對4基因編碼的蛋白進行全面的生物信息學及低溫和硅酸鉀響應分析，結果顯示低溫脅迫后4基因在葡萄葉片中表達水平上調，說明4基因可能參與了葡萄葉片低溫脅迫的響應。低溫條件下施加硅酸鉀后，4基因在不同的葡萄組織中對硅酸鉀的響應不同，說明該基因表達具有組織特異性。本研究對深入了解4基因在葡萄非生物逆境脅迫中的功能，分析CBF4蛋白對植物抗逆的分子機制，以及深入探究外源硅對葡萄抗寒調節機理，為甘肅乃至北方釀酒葡萄抗寒栽培提供理論基礎和實踐指導。