香合歡EST-SSR標記開發及種間通用性研究

安 琪， 馮源恒， 楊章旗*， 胡 拉

( 1. 廣西師范大學 生命科學學院， 廣西 桂林 541006； 2. 廣西壯族自治區林業科學研究院廣西馬尾松工程技術研究中心， 南寧 530002 )

遺傳多樣性作為保護生物學研究的核心內容之一，是生物經長期進化的產物。群體遺傳多樣性研究對于評價一個群體對環境變化的適應能力，揭示該物種生物多樣性和生態系統功能的維持機制及受威脅因素，對該物種種質資源有效保護相關策略的制定至關重要(孟藝宏等，2020)。香合歡()為豆科(Leguminosae)含羞草亞科(Mimosaceae)合歡屬(Durazz)常綠大喬木，在我國福建、廣東、廣西、貴州、云南、四川、海南等省(區)均有分布(韋鑠星等，2020)。香合歡具有生長迅速、出材率高、天然更新能力強等優點，是具有巨大發展潛力的高價值造林樹種。此外，香合歡還具有極高的藥用價值。以根入藥，可用于治療風濕關節痛、跌打損傷、創傷出血、瘡癬、失眠等癥狀(蔡永敏，1996；蔣升湧，2003)。香合歡作為高經濟價值樹種，雖然自20世紀90年代起吸引了不少學者的目光，但大多集中在群落組成特征、藥用價值探討、培育栽培技術等方面，有關該樹種種質資源的群體遺傳學卻研究較少，并缺乏可用的分子標記。

除香合歡外，合歡屬及其近緣樹種中有許多優質的用材樹種，如合歡屬的黃豆樹()、金合歡屬()的黑木相思()、南洋楹屬()的南洋楹()、格木屬()的格木()。對這些樹種的相關研究同樣集中在栽培技術、群落組成和分布特征、藥用價值研究等方面，而群體遺傳學方面卻十分薄弱。目前，僅金合歡屬公開發表過82對SSR引物，而合歡屬、南洋楹屬、格木屬尚未有相關SSR引物的報道，從而限制了對各樹種分子遺傳方向的深入研究。若想開展各樹種遺傳多樣性評價、比較基因組學、基因表達圖譜的構建等分子遺傳方面的研究，適宜分子標記的開發勢在必行。簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)指由 1～6 個核苷酸為重復單元串聯組成的長達幾十個核苷酸的重復序列，也叫微衛星標記(microsatellite)(Tautz，1989)，因其數量豐富、遍布真核生物整個基因組、多態性高、重復性好、共顯性遺傳、特異性強等優點而被廣泛應用于物種遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜的構建、基因定位和分子標記輔助育種等研究(Powell et al.，1996)。按其來源可分為基因組SSR(G-SSR)和表達序列標簽SSR(EST-SSR)兩類。其中，G-SSR標記基于基因組序列，其開發過程繁復、成本高、效率低；EST-SSR是基于表達序列標簽開發微衛星的一種新型分子標記，除具有G-SSR標記的優點外，還具有序列保守性較高、在植物物種之間通用性的優點(張利達和唐克軒，2010；王丹丹和楊東霞，2017；Preethi et al., 2020)。鑒于此，本文基于香合歡轉錄組測序結果開發相關分子標記。

近年來，眾多研究表明，SSR引物在物種及其近緣物種間，甚至在該物種與某些遠緣物種間均具有一定的通用性(鐘敏等，2012)。 張燕梅等(2020)發現劍麻EST-SSR引物在龍舌蘭屬、絲蘭麻屬和中美麻屬中的通用性分別為68%、52% 和52%。張勇等(2019)發現66.67% 的桃EST-SSR引物在薔薇科物種中擴增出多態性。方書生等(2018)發現棉花SSR標記在紅麻中的通用性為53.5%?？梢姡诮壩锓N間探討EST-SSR引物的通用性有效且可行。本研究基于香合歡轉錄組測序結果設計開發EST-SSR引物，對其在香合歡、黃豆樹、黑木相思、南洋楹、格木中的通用性進行研究，將現有引物轉移到黃豆樹、黑木相思、南洋楹、格木等近緣樹種上，既可有效節約引物開發成本，提高引物的利用效率，也可為香合歡、黃豆樹、黑木相思、南洋楹、格木及其他一些近緣物種的種質資源保護、遺傳多樣性等相關研究提供可靠分子標記。

1 材料與方法

1.1 材料

選取30份香合歡種質作為香合歡引物多態性研究的材料。另外，選取香合歡、黃豆樹、黑木相思、南洋楹、格木種質資源各4份，作為引物通用性研究的材料(表1)。其中，格木和黑木相思材料均采自南寧市林業科學研究所，4份香合歡材料分別為廣西百色市田東縣地方種、廣西百色市西林縣地方種、海南省尖峰嶺地方種、海南省霸王嶺地方種，4份南洋楹材料中2份采自廣東省林科院樹木園、2份采自廣西壯族自治區林業科學研究院，4份黃豆樹材料采自廣西壯族自治區林業科學研究院。格木、黑木相思、黃豆樹材料由于取樣地距離較近且取材較方便，因此采樣后立即放入采樣箱中，隨后將樣品放入-80 ℃冰箱進行保存；而香合歡和南洋楹材料因為取樣地距離較遠且取材較難，所以采集新鮮樣品后立即放入硅膠中干燥保存。

表 1 50份供試材料的種質信息Table 1 Germplasm information of 50 tested materials

1.2 SSR標記開發

1.3 DNA提取

植物基因組DNA的提取是使用液氮將香合歡及其近緣物種的葉片研磨成粉末狀，采用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取DNA， 使用微量分光光度計對提取好的DNA的濃度進行檢測，置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 PCR擴增

PCR擴增反應總體積10 μL，含1 μL DNA(60 ng·μL)，0.2 μL dNTPs，上下游引物各0.25 μL，1 μL的10 × PCR Buffer，0.1 μL的Taq DNA Polymerase (5 U·μL)，7.2 μL的ddHO，擴增反應在PCR儀上進行。擴增程序為94 ℃預變性4 min，94 ℃變性 15 s，58 ℃ 復變性 15 s，72 ℃ 延伸 30 s，25 個循環；72 ℃ 延伸 20 min，12 ℃保存。

1.5 擴增產物的檢測

用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產物，在240 V恒壓下電泳(一般為50～55 min)，可根據溴酚藍指示劑的位置調整電泳時間。首先，將凝膠用dd HO清洗2次后，在固定液中固定10 min，隨后取出凝膠用蒸餾水清洗2次，每次清洗2 min；然后，將凝膠放入0.15% AgNO溶液中染色6～7 min，用dd HO清洗2次，每次2 min，隨后將凝膠放入顯影液中至條帶清晰，用dd HO清洗2次后讀帶并拍照。

1.6 數據統計與處理

用人工讀帶的方法讀取條帶，同一引物擴增產物中用A，B，C，…按條帶長度從大到小進行編號，利用Popgene 1.32軟件計算30份樣品的遺傳多樣性指數。

計算所用SSR引物的(polymorphism information content)(楊國忠等，2004)。計算公式如下：

(1)

式中：為多態信息含量；和分別為第個和個等位基因頻率；為等位基因數。

引物的有效擴增率為能夠有效擴增的引物的數量與引物總數量的比值。

2 結果與分析

2.1 香合歡轉錄組中SSR重復單元類型

通過對香合歡9個樣本進行RNA轉錄組測序獲得33 335個SSR位點，對SSR的重復基元類型進行統計，發現主要有單核苷酸和二至六核苷酸等6種重復基元類型(表2)。其中，單核苷酸重復類型占SSR位點總數的64.73%，二核苷酸重復類型占SSR位點總數的20.64%，三核苷酸重復類型占SSR位點總數的12.30%，四至六核苷酸重復類型分別占SSR位點總數的1.62%、0.28%、0.42%。

自19世紀50年代吉林省開展滑雪運動以來，冰雪旅游的發展受到了政府的高度重視。根據《2016年吉林省旅游業發展報告》，截至2016年底，全省共有27所旅游院校，旅游培訓師資隊伍1375人，旅游院校在校學生6700人。旅游專業院?？梢詾楸┞糜屋斔痛罅康姆蘸凸芾砣瞬牛潜┞糜蔚陌l展還離不開專業的滑雪指導員和教練、專業的穿戴滑雪設備的研發設計人才和專業的冰雪規劃和場地的建設人才。這些專業人才的缺乏，正是吉林省開展冰雪旅游的人力資源短板。

表 2 香合歡轉錄組中SSR重復單元的分布特征Table 2 Distribution of the SSR repeat motifs in Albizia odoratissima transcriptome

從表2可以看出，在單核苷酸重復類型中 T/A(45.07%)最多，A/T(44.73%)稍次之；二核苷酸重復類型中出現頻率最高的為AT(16.97%)，其次是TA(14.34%)和AG/CT(12.42%)；三核苷酸重復類型中AAT/ATT(4.85%)出現的頻率最高，GAA/TTC(4.59%)和TTC/GAA(4.24%)稍次之；四核苷酸重復類型中AAAT/ATTT(9.98%)出現的頻率最高，其次為TTTA/TAAA(9.06%)。核苷酸重復類型一共有399種，除去單核苷酸重復類型的四種，二核苷酸重復類型、三核苷酸重復類型、四核苷酸重復類型、五核苷酸重復類型、六核苷酸重復類型分別有12、60、123、65、135種。

SSR的重復次數在5～68之間(表3)。其中，5～11次重復最多，占SSR位點總數的54.95%；12～18次重復排在第二位，占SSR位點總數的34.48%；19～25次重復占SSR位點總數的7.74%；重復次數高于25數量較少，僅占總位點數量的2.83%。在所有重復次數中，10次重復最多有5 792(17.38%)個，其次為11次重復和6次重復，分別有3 441個(10.32%)和2 926個(8.78%)。

表 3 SSR重復次數Table 3 SSR repetition times

2.2 香合歡EST-SSR引物的有效性

從表4可以看出，在243對香合歡EST-SSR引物中，有155對能夠在香合歡中有效擴增。并且，不同核心重復類型的EST-SSR引物的有效擴增率有所不同，其中三核苷酸重復類型引物的擴增成功率(為66.34%)高于五核苷酸重復類型(為64.71%)和四核苷酸重復類型(為61.11%)的EST-SSR引物。

表 4 香合歡EST-SSR引物在5個樹種中的擴增結果Table 4 Amplification results of EST-SSR primers of Albizia odoratissima in five tree species

2.3 SSR標記多態性信息

243對引物中，有37對能夠在香合歡中擴增出多態性條帶，多態性比率為23.87%。篩選出10對條帶清晰、重復性好、多態性高的引物， 對30份香合歡種質進行鑒定，結果表明10對引物共擴增出26條條帶(圖1)，平均每對引物擴增出2.6條。使用Popgene 1.32 軟件分析10對引物的多樣性指數(表5)，其有效等位基因數的范圍為1.149 7～2.455 7，平均值為1.816 4；Nei’s 基因多樣性指數()的范圍為 0.130 2～0.592 8，平均值為0.420 9；Shannon指數()的范圍為 0.289 7～0.984 0，平均值為 0.677 1； 根據Botstein等 (1980)首次提出的>0.5 時，引物具有高度多態性；0.5<<0.25 時，引物具有中度多態性；<0.25 時，引物具有低度多態性。10對引物值的范圍為 0.124 9～0.518 4，平均值為 0.351 7，除AO-130和AO-133為低度多態性引物外，其他均屬于中高度多態性引物，表明所篩選引物可以用于香合歡種質遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建。

表 5 10對引物多態性信息Table 5 Information on polymorphism of 10 pairs of primers

1-30. 供試的30份香合歡材料。1-30. 30 tested materials. 圖 1 利用引物AO-53 (A) 和AO-62 (B) 對30份香合歡種質擴增條帶圖Fig. 1 Amplification bands of 30 Albizia odoratissima germplasms using primers AO-53 (A) and AO-62 (B)

2.4 香合歡EST-SSR引物的通用性分析

由表4可知，在成功擴增的171對引物中，三核苷酸重復類型在黃豆樹、南洋楹、黑木相思、格木中的有效擴增率分別為34.65%、42.57%、44.55%、15.84%；四核苷酸重復類型在黃豆樹、南洋楹、黑木相思、格木中的有效擴增率分別為32.41%、44.44%、41.67%、12.04%；五核苷酸重復類型在黃豆樹、南洋楹、黑木相思、格木中的有效擴增率分別為38.24%、52.94%、35.29%、20.59%。此外，五個樹種均通用的引物有18對，香合歡、黃豆樹、黑木相思、格木特異性標記分別有26對、8 對、5 對和1對，未發現南洋楹特異性標記。

有10對能夠在黃豆樹中擴增出多態性條帶，多態性比率為12.20%，有10對能夠在南洋楹中擴增出多態性條帶，多態性比率為9.01%，有4對能夠在黑木相思中擴增出多態性條帶，多態性比率為3.96%，有1對能夠在格木中擴增出多態性條帶，多態性比率為2.78%。有2對引物能夠在3個以上樹種中擴增出多態性條帶。部分引物在各樹種的擴增結果見圖2。

1-4. 黃豆樹; 5-8. 格木; 9-12. 香合歡； 13-16. 南洋楹； 17-20. 黑木相思。1-4. Albizia procera; 5-8. Erythrophleum fordii; 9-12. Albizia odoratissima; 13-16. Falcataria falcata; 17-20. Acacia melanoxylon.圖 2 引物AO-63 (A) 和引物AO-196 (B) 在不同樹種的擴增條帶圖Fig. 2 Amplification bands of primers AO-63 (A) and AO-196 (B) in different tree species

香合歡EST-SSR引物在香合歡及其他樹種的通用性比率三核苷酸重復類型引物平均為71.29%，四核苷酸重復類型引物平均為70.37%，五核苷酸重復類型引物平均為67.65%。可見，不同核心重復類型的香合歡EST-SSR引物的通用性有所不同，三核苷酸重復類型EST-SSR引物的通用性比率高于四核苷酸重復類型引物和五核苷酸重復類型引物。

3 討論與結論

3.1 香合歡EST-SSR引物的通用性

在植物中三核苷酸重復類型的EST-SSR引物的通用性比率高于其他核心單元重復類型的引物(Chen et al., 2005; Li et al., 2008文明富等，2011；)。本研究中，三核苷酸重復類型的香合歡EST-SSR引物通用性比率(為71.29%)高于四核苷酸重復類型(為70.37%)和五核苷酸重復類型引物(為67.65%)，表明在香合歡中，三核苷酸重復類型EST-SSR引物的通用性也最高。

本研究對所設計的243對香合歡EST-SSR引物進行通用性篩選，發現有效擴增率為70.37%，這與Gao等(2003)，祁雅等(2004)和魏利斌等(2008)研究指出的，所設計EST-SSR引物的有效擴增率應在60%～90%之間相吻合。其原因可能有以下幾個方面：一是實驗中所用引物均根據二代測序結果所得，二代測序在拼接過程中可能會存在一些錯誤，導致引物設計不合理，因而不能有效擴增；二是根據轉錄組測序結果設計和篩選EST-SSR引物時，可能會出現所設計引物GC含量過高，形成二聚體或發卡結構等情況，從而影響聚合酶鏈式反應使引物不能擴增出有效的目的片段(鐘敏等，2012)。

本研究發現在成功擴增出目的條帶的171對引物中，有26對引物在其他4種樹種中不具備通用性，這與鐘敏等(2012)發現有216對引物僅在綠豆種中能夠有效擴增的結果相似，其原因可能是這些EST-SSR位點為香合歡特有，這些香合歡特異性引物可為香合歡野生種或是近緣物種的分類和鑒別研究提供參考。

SSR引物的通用性與近緣分類群之間微衛星側翼序列的保守性和進化過程中微衛星的穩定性息息相關?；蚪M編碼區序列的保守性高于非編碼區，EST-SSR來源于編碼區序列，與功能基因相關，由于EST-SSR序列保守性較基因組SSR高，因此EST-SSR較基因組SSR的通用性高，且一般遺傳距離越近的物種間引物的通用性越高(Liewlaksaneeyanawin et al., 2004；洑香香等，2011；文明富等，2011)。李春和孫曄(2012)發現124對中國板栗多態性EST-SSR引物在栲樹中通用性和多態性分別為42.7%和56.6%。Feng等(2014)發現318對馬尾松SSR引物分別有15對、10對和10對在濕地松、加勒比松、云南松中擴增出了多態性條帶。徐楊等(2016)通過研究發現云南松EST-SSR引物在細葉云南松、馬尾松、高山松、油松等近緣物種中具有較高的通用性。本研究中香合歡EST-SSR引物在各樹種的通用性比率香合歡(63.79%)>南洋楹(45.68%)>黑木相思(41.56%)>黃豆樹(33.75%)>格木(14.81%)。其原因可能是黃豆樹、南洋楹和黑木相思同屬于含羞草亞科(Mimosaceae)植物，而格木為蘇木亞科(Caesalpinioideae)植物，黃豆樹、南洋楹和黑木相思與香合歡之間的親緣關系較格木更近，因而同源序列更多，擴增成功率相對更高。但是，在南洋楹和黑木相思中的通用性比率高于黃豆樹，在一定程度上預示著香合歡與南洋楹、黑木相思的轉錄組信息更為近似，這與分類學上的親緣關系遠近并不完全一致，此種表型分類學與基因組學上的親緣差異值得進一步深入探討。由于本研究所設計引物數量有限，并未包含香合歡全部EST-SSR序列，可能會對引物通用性結果造成一定影響。為準確驗證引物間的通用性規律，得到更加科學客觀的結論，還需做大量研究，今后可在本研究的基礎上采用更多引物在同種、同科、同屬植物中進行廣泛測試。

3.2 香合歡EST-SSR引物的多態性

一般來說，EST-SSR引物的多態信息含量的值會因物種、供試材料數量以及標記數目的變化而有所不同(魏利斌等，2008)。本研究發現，在香合歡中擴增出多態性條帶的引物有37對(23.87%)，選用30份香合歡種質對10對多態性高、重復性好的SSR引物的多態性進行分析，平均每對引物擴增出多態性條帶2.6條，僅引物AO-130和AO-133為低度多態性引物。其原因可能與本研究所用30份香合歡種質均為廣西百色市隆林縣地方種，材料間遺傳背景差異較小且材料數量較少有關。在未來的工作中要加強對不同的地域、類型的香合歡種質的搜集和利用。此外，在黃豆樹、南洋楹、黑木相思和格木中擴增出多態性條帶的引物分別有10對(12.20%)、10對(9.01%)、4對(3.96%)、1對(2.78%)。本研究可基本滿足香合歡、黃豆樹、南洋楹的種質資源遺傳多樣性等研究需要，若想進一步分析香合歡引物在黑木相思和格木的多態性，可進一步增加篩選引物所用材料的數量，且最好選擇不同省份或是不同國家來源的野生群體等差異較大的材料。

目前，對于香合歡、黃豆樹、南洋楹、黑木相思、格木等豆科高經濟價值、生態效益樹種的基因信息的了解和研究還很缺乏，本研究獲得的通用性引物將為繼續深入開展香合歡遺傳多樣性與種質資源保護等研究提供幫助，也將進一步促進香合歡的一些近緣物種甚至一些遠緣物種尤其是黃豆樹、南洋楹、黑木相思、格木4個樹種的種質資源的收集、保護、鑒定、遺傳多樣性分析等研究的開展。