‘蘭引3 號’結縷草足球場叢枝菌根真菌多樣性及菌群結構分析

張楚婷，彭雪，宋玉，辛國榮

（有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室，中山大學農學院，廣東 廣州 510275）

2016年5月國家發改委在《全國足球場地設施建設規劃（2016-2020年）》［1］中明確提出了建設目標：到2020年，全國足球場地數量超過7 萬塊，平均每萬人擁有足球場地達到0.5 塊以上，有條件的地區達到0.7塊以上。如果按照標準足球場長105 m、寬68 m 來計算，在2020年國內足球場面積應達到4 998.00 萬m2。足球場是全民健身活動場地的重要組成部分，良好的足球場草坪能優化城市景觀、減少運動傷害，從而提高公眾的生活質量。

‘蘭引3 號’結縷草（Zoysia japonica‘Lanyin No.3’）是一種優良的運動型草坪草，具有生長快速、耐踐踏、抗性強、成坪時間短和易于管理等優良性狀［2］，在我國南方地區被廣泛用以建植足球場草坪。為了保證‘蘭引3 號’結縷草草坪良好的景觀效果以及使用體驗，管理人員需要采取高頻率的管理措施，如澆水、施肥、刈割和噴灑農藥等。在密集的管理措施下，‘蘭引3 號’結縷草雖然維持了良好的景觀效果和優質使用體驗，但高額的經濟投入、資源的浪費以及在管理中所潛在的環境問題日益凸顯。而合理地施用叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）生物菌劑將會為‘蘭引3 號’結縷草足球場草坪管理提供新思路，但與‘蘭引3 號’結縷草的AMF 侵染特征有關的研究卻較少。現有的研究基礎較為薄弱，并不利于‘蘭引3 號’結縷草草坪叢枝菌根真菌生物菌劑的篩選與未來的生產應用。

菌根（Mycorrhiza）是土壤中一定種類真菌與植物根系所建立的互惠共生體，而叢枝菌根真菌是其中生物量最大、最重要的成員之一。AMF 能夠與大部分的植物形成共生關系，菌絲網的形成不僅擴大了根部的吸收范圍，讓植物通過菌絲吸收利用原本吸收不到的養分，促進植物對礦質養分（特別是磷）的吸收，提高植物的抗病能力以及植物在逆境中的生存能力，還能夠加強鄰株植物之間營養元素的傳遞，故菌絲網對植物個體間營養平衡和物種多樣性維持等具有重要的生態功能［3］。菌絲網和菌根真菌分泌的球囊霉素相關土壤蛋白也能夠促進土壤團聚體的形成［4］，改善土壤的物理結構。由于AMF 具有重要的生理生態功能，應用前景廣闊，AMF 應用技術的研究與開發已成為值得重點關注的領域。

合理施用AMF 生物菌劑有助于改善足球場草坪草養護，以緩解管理過程中過多消耗水肥資源的問題。以廣州市4 個采用‘蘭引3 號’結縷草建植的足球場為研究對象，通過擴增子測序手段，對‘蘭引3 號’結縷草足球場草坪草根際AMF 侵染特征、AMF 群落結構及多樣性進行基礎調研，為篩選適用于‘蘭引3 號’結縷草足球場草坪的AMF 菌劑提供基礎研究資料。

1 材料和方法

1.1 采樣情況

研究選取廣州市4 個足球場作為采樣樣地，4 個足球場的草坪草均為‘蘭引3 號’結縷草。

樣地1：天河體育中心（天河區，簡寫TH），位于天河區天河路，竣工于1987年，總占地面積51 萬m2，是廣州目前最大的體育場地；

樣地2：廣東奧林匹克體育中心（天河區，簡寫OT），位于天河區東圃鎮黃村，總占地面積14.56 萬m2，2001年9月31日竣 工；

樣地3：大學城體育中心體育場（番禺區，簡寫DXC），位于大學城中心區，于2007年啟用，總占地面積9.7 萬m2，是廣州第3 大體育場；

樣地4：中山大學英東體育場（海珠區，簡寫YD），位于海珠區新港西路中山大學校內，建于1988年，由霍英東先生出資修建。

天河體育中心、廣東奧林匹克體育中心、大學城體育中心體育場是廣州市主要的大型體育場，使用頻次高，養護狀況良好；而英東體育場建坪年限最久，使用頻次高，養護狀況較差。4 個足球場基本能夠代表廣州市‘蘭引3 號’結縷草足球場的基本情況。

于2016年7月29日對4 個足球場進行采樣。當日天氣晴朗，溫度27~36 ℃（廣州天氣網）。分別于距足球場草皮邊緣約2.5 m 的四角處（即每個足球場取4個重復），取長×寬×深為5 cm×5 cm×7 cm 的立方樣塊，每個樣點按照三點取樣法進行取樣，將取到的植株的根系和地上部全部保存于密封袋，將取到的結縷草根際附著的土壤抖落于密封袋中，做好標記。置于含有冰袋的泡沫保溫箱中，帶回實驗室后盡快處理。

1.2 擴增子測序

將采集的植物根樣用冰水洗凈附著的泥土，放于-20 ℃冰箱保存，7 d 內將根部樣品同土壤樣品送美吉生物有限公司（上海）進行DNA 抽提擴增與測序。本次測序樣品共送32 個，植物地下部及對應根際土壤的樣品各16 個，每組4 個重復。抽提后的DNA用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用巢式PCR（ABI GeneAmp? 9700 型）對抽提后的DNA 進行擴增。巢式PCR 擴增引物采用Van Geel M 等［5］研究結果中的引物序列（表1），其在核糖體RNA（rRNA）小亞基（SSU）上的位置如圖1。PCR 完成后取4 μL 樣品進行2%瓊脂糖凝膠電泳，用于檢測PCR 產物。對PCR產物進行熒光定量和均一化后，進行Illumina 平臺文庫構建，用磁珠純化后利用PCR 擴增進行文庫模板的富集，最后采用Miseq PE300 對序列進行測序。

圖1 目標擴增片段與引物在SSU rRNA 基因上的示意圖Fig.1 Schematic map indicating the target region of SSU rRNA gene and primer locations

表1 巢式PCR 擴增引物序列表Table 1 The sequence of amplification primers for nested PCR

1.3 孢子密度與AMF 侵染程度的計算

取出保存于-20 ℃冰箱中剩余的土壤和根系樣品，采用濕篩傾析法［6］處理其中的部分土壤，在體視顯微鏡下觀察并統計5 g 土壤樣品中的孢子數量，計算孢子密度；將根系樣品用臺盼藍染色法［7］對根段進行染色，后用放大交叉法［8］進行鏡檢，確定AMF的侵染程度。

1.4 測序結果處理與分析

對原始reads 進行質控與過濾（Trimmomatic［9］），根據PE reads 之間的overlap 關系，將成對的reads 拼接 成Tags（FLASH［10］）。在97% 的 相 似 水 平 下 對Tags 進行聚類，得到多個OTU（Operational taxo?nomic units）（Usearch V7.1［11］）。對 聚 類 后 的 代 表OTU 進行注釋和分類。在70% 相似水平下比對Unite［12］（Release 7.0http：//unite. ut. ee/index. php）數據庫進行物種分類學分析，并統計各個分類水平（domain，kingdom，phylum，class，order，family，genus，species）的群落組成。

根據測序結果，抽取部分序列進行分析。利用mothur［13］進 行rarefaction 分 析，利 用R 語 言 工 具 繪 制物 種 稀 釋 曲 線 圖；利 用mothur［13］計 算Chao、Ace、Simpson 及Shannon 指數，用SPSS 22.0 進行單因 素 方差分析（One-way ANOVA）并進行顯著性檢驗；用R語言工具進行Venn 圖、群落結構圖和相對豐度熱圖的繪圖。

2 結果與分析

2.1 足球場草坪草AMF 侵染特征與土壤孢子密度

對4 個足球場‘蘭引3 號’結縷草根際叢枝菌根真菌侵染率調查后發現，4 個足球場叢枝菌根真菌的侵染形式以菌絲侵染為主（圖2），泡囊侵染次之，少有或鮮有叢枝結構。YD 草坪草根際AMF 的菌絲侵染率達44%，TH 與OT 草坪草根際菌絲侵染率次之，分別為37%和33%，DXC 草坪草的菌絲侵染率僅達28%；泡囊侵染率YD 為12%，遠高于OT（3%），且差異顯著（P<0.05），而TH 與DXC 分別達到9%和6%。總侵染率變化與菌絲侵染率變化趨勢相似（圖3）。

圖2 ‘蘭引3 號’結縷草根際AMF 菌絲結構Fig.2 Microscopic observation of AMF hypha in roots ofZoysia japonica‘Lanyin No. 3’

圖3 4 個體育場‘蘭引3 號’結縷草根際AMF 侵染率Fig.3 AMF colonization rate ofZoysia japonica‘Lanyin No.3’root in four studied sport fields

對根際土壤的孢子密度進行調查可知（圖4），YD以66 個/g 土壤的孢子數顯著高于其他3 個體育場，而OT、DXC 和TH 的 土 壤 的 孢 子 分 別 為37、28 和15 個/g。

圖4 4 個體育場坪床基質內處理AMF 孢子密度Fig.4 AMF spore density in the substrate of turf-bed in four studied sport fields

2.2 AMF 群落特征

原始測序進行質控后共測有效序列484 810 條，平均每個樣品測序條數為15 150 條。根據物種稀釋曲線（圖5）可知，序列數-物種數曲線在序列數大于9 000 后趨于平緩。可以確定在試驗條件下，樣本的測序數據量合理，可以覆蓋大部分的物種。為保證每個樣本的測序量相同，每個樣本隨機選取9 870 對測序片段進行后續生物信息學分析。

圖5 物種稀釋曲線Fig.5 Species rarefaction curves

對4 個足球場草坪草根內和根際土壤中OTU 數量與種類進行分析（圖6?A，6?B），四個體育場草坪草根際土壤中OTU 種類有12 個（圖6?A），根內共有OTU 種類為11 個（圖6?B）。進一步對共有OTU 進行注釋后發現，其中4 類OTU 是根內所獨有，其中2 類是屬于球囊霉目（Glomales）球囊霉科（Glomeraceae）球囊霉屬（Glomus）的真菌，剩下的2 類則分別屬于類球囊霉科（Paraglomeraceae）類球囊霉屬（Paraglomus）和多孢囊霉目（Diversisporales）無梗囊霉科（Acau?losporaceae）無梗囊霉屬（Acaulospora）；同樣，在土壤中也有3 類OTU 是根內所不具有的，注釋后發現其中2 類是來自球囊霉科球囊霉屬的真菌，而另一類是來自多孢囊霉目無梗囊霉科無梗囊霉屬的Acaulospora?Acau8?VTX00047。此外，各個足球場之間AMF 群落的構成差異較大，同一足球場草坪草根內與根際土壤的物種相對豐度存在一定差異（圖6?C，6?D）。

總體上，四個足球場草坪草根內以及根際土壤中主要是球囊霉屬（Glomus）的真菌占了整個群落結構的大部分，其次就是盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）以及無梗囊霉屬（Acaulospora），類球囊霉屬（Paraglo?mus）最少，而巨孢囊霉屬（Gigaspora）與多孢囊霉屬（Diversispora）則在部分足球場中出現。

4 個足球場間結縷草根內真菌相對豐度具有較大差異。其中DXC 與OT 結縷草根內真菌類別最多，均有5 屬，除了球囊霉屬真菌以外，還有無梗囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、類球囊霉屬、巨孢囊霉屬真菌。但是DXC 草坪草根內有一部分真菌未被鑒定出。另外，從OT 草坪草根內鑒定出多孢囊霉屬真菌。TH 草坪草根內真菌已鑒定出的屬僅有2 類，其中球囊霉屬真菌占比達到了82.2%，是OT 草坪草根內的2.3 倍（35.3%），另一種是類球囊霉屬，占4.4%，其余的均未鑒定出屬。

4 個足球場根際土壤中的真菌（屬水平）除了在相對豐度上與根內有一些差別外，土壤中的真菌組成與根內真菌組成基本一致，但在TH 的根際土壤中檢測出了無梗囊霉屬真菌。根際土壤中的真菌同樣主要以球囊霉屬真菌為優勢屬，其中在YD 和TH 的占比分別為76.2%、69.2%，高于DXC（54.8%）以及OT（46.6%）。值得注意的是，只在DXC 與OT 鑒定出了盾巨孢囊霉屬真菌。

在種水平上對4 個足球場草坪草根內以及根際土壤中AMF 群落結構作進一步分析（圖6?D），共從6 個屬中鑒定出39 個種。草坪草根內與根際土壤中豐度較高的是Glomus?Glo3b?VTX00069 以及球囊霉屬中大部分未被鑒定種的真菌。可以看出盾巨孢囊霉屬中未鑒定的種（Scutellospora_unclassified）主要存在于OT 與DXC，少量存在于其他兩個足球場。

圖6 樣品OTU 分布以及物種分布Fig.6 OTU distribution and species distribution

2.3 AMF 多樣性指數

對所有樣品的α 多樣性指數進行計算（表2），在4個足球場中，除了YD 以外，同一足球場草坪草根內與土壤中的AMF 多樣性指數沒有顯著差異；4 個足球場的土壤AMF 多樣性具有一定差異，且草坪草根內AMF 多樣性也有顯著性差異。

從OTU 分類數量來看，YD 的‘蘭引3 號’結縷草根內與土壤中的OTU 數量都高于其他足球場，OT 次之，DXC 與TH 分列第3 與第4。值得注意的是，以結縷草根內檢測出的OTU 數量進行比較，YD 與OT 顯著高于DXC 與TH，YD 與OT 間并無顯著差異，而4個足球場的土壤AMF 多樣性也出現了相同的顯著性變化趨勢，但是YD 的土壤AMF 多樣性顯著高于OT。

Ace 指數和Chao 指數是衡量物種豐富度（物種數目）的指標。表2 結果表明，DXC、OT 以及TH 結縷草根內AMF 的物種數目與根際土壤中的數目相當，YD的根內AMF 的物種數目顯著低于根際土壤中的數目（PAce=0.043，PChao=0.050）。從Ace 指數分析可知，在4 個足球場，根內AMF 多樣性沒有顯著差別；在根際土壤AMF 的多樣性上，YD 顯著高于其他3 個足球場，OT 根際土壤中AMF 的多樣性也顯著高于TH 與DXC。從Chao 指數來看，4 個體育場的根內AMF 多樣性狀況為：YD 與OT 顯著高于TH 以及DXC。

Shannon 指數與Simpson 指數作為衡量物種多樣性的常用指標，不僅體現了物種豐富度，還體現了物種分布的均勻度。Shannon 指數越高、Simpson 指數越低，物種多樣性就越高。表2 結果表明：YD 草坪草根內AMF 的Shannon 指數顯著高于DXC、OT 以及TH草坪草根內的Shannon 指數，而且YD 土壤中AMF 的Shannon 指數也顯著高于DXC、OT 以及TH 土壤中的Shannon 指數；而Simpson 指數與Shannon 指數的變化趨勢不同，YD 草坪草根內AMF 的Simpson 指數顯著小于其他3 個體育場根內的Simpson 指數，且YD 土壤中AMF 的Simpson 指數也顯著小于其他3 個體育場土壤中的Simpson 指數。

表2 4 個體育場‘蘭引3 號’結縷草根內與土壤中AMF 多樣性指數Table 2 AMF community diversity indices of root and soil from four sport fields

3 討論

3.1 ‘蘭引3 號’結縷草足球場草坪的AMF 侵染情況

調研結果發現，4 個足球場的‘蘭引3 號’結縷草均與AMF 形成了共生結構，在根內主要以菌絲侵染為主，泡囊結構次之，少有或罕有叢枝結構。4 個足球場結 縷 草的AMF 侵染特 征 與Han 等［14］對細 葉 結 縷 草AMF 侵染狀況的調查結果、李軍帥［15］對禾本科內11個種根內AMF 侵染狀況的調查結果基本一致。

4 個足球場結縷草根際的AMF 侵染率均達到了25%以上，其中英東體育場（YD）結縷草根際AMF 菌絲侵染率達到44%，且其孢子數達到66 個/g 土壤，顯著高于其他3 個體育場。之所以造成這一現象，除了因為天河體育場（TH）、奧體中心體育場（OT）分別于2015年、2016年重新換坪之外，更可能是因為YD 自2002年換坪以后，只進行日常的養護管理，因此各方面的養護水平均不及其他3 個足球場。而AMF 形成的菌絲網能增加植物根系與土壤的接觸面積，增強宿主在惡劣環境中的耐性［16］并且輔助宿主對水分和養分［17］的吸收，李俠等［18］也發現AMF 的根外菌絲密度與宿主植物的地上部生物量、菌根對磷和鋅的吸收效應之間有顯著的正相關關系。因而YD 的‘蘭引3 號’結縷草能夠通過發達的菌絲網獲取土壤中的水分和養分，維持自身正常的生長發育。

本研究發現，同一足球場‘蘭引3 號’結縷草根內與根際土壤中AMF 群落組成（屬水平）無顯著區別，只是在豐度上有些許差別；而4 個足球場之間，AMF群落組成（屬水平）和相對豐度都存在較大差異。有一部分真菌未被鑒定出屬或種，這可能是由于對小亞基（SSU）rRNA 上的部分片段進行PCR 擴增后再進行對比的方法仍然不夠完善［19］，片段的長度范圍內提供的序列信息不足以對群落中的所有AMF 進行種屬的準確鑒定。為進一步了解與研究AMF，也應該重視對AMF 種屬的分子鑒定工作，完善AMF 數據庫，為后續科學試驗奠定分子基礎，同時為AMF 菌劑能早日在生產上投用打下堅實的理論基礎。

3.2 影響AMF 菌劑的因素

土壤作為一個復雜的生態環境，包含真菌、細菌、原生動物、病毒等多種生物。其中AMF 作為真菌中重要的一部分，其與植株形成的菌絲網為植物和土壤架起了另一條水肥通道。菌根真菌一旦侵染植物根系，就會從根系放射出菌絲形成濃密的菌絲網，這種菌絲網能夠吸收大量的營養和水分，并將這些原料轉運回植物根系。許多研究表明，AMF 促進了草坪草對養分（尤其是磷）的吸收，能夠提高草坪草對養分的利用效率。彭雪等［20］發現在草坪建植過程中選取適當的基質輔以AMF 菌劑，能夠減少基質中水分、硝酸根離子、磷酸根離子和鉀離子的流失；AMF 還能夠通過增加基質中有效磷的含量并減少滲瀝液中的磷，在一定程度上抑制磷元素的流失［21］。此外，AMF 的外延菌絲還可通過侵入點再度侵染鄰株植物根系，在多株相同或不同植物之間形成龐大的地下公共菌絲網（Common mycorrhizal networks，CMN），CMN 的形成對植物間的資源再分配有重要作用［22］。從AMF 菌劑添加到土壤的效應來看，菌根在改善草坪草質量、完善草坪管理中起到舉足輕重的作用。

AMF 雖然廣泛分布于地球上很多不同的生態系統中，但AMF 的群落組成一般會受到土壤因子和宿主植物種類的影響［23］，土壤pH 和土壤碳、氮含量等理化因子都會強烈影響AMF 的群落組成［24-25］。而且，不同的土壤類型以及土地使用強度也能夠顯著影響AMF 孢子的群落結構及多樣性水平［26］。因此在考慮AMF 菌肥的菌種組成時，需要具體考慮AMF 種類對于土壤理化因子的適應能力。而且，土著AMF 對于植物的促生作用比商業菌劑更加顯著［27］，可能就是由于土著AMF 更加適應土壤的各項理化性質［28］。而在不同生態系統中，球囊霉屬Glomus在AMF 群落結構中都較有優勢，說明球囊霉屬真菌對不同的環境都具有良好的適應性。

在實際情況中，球場草坪草根內與周圍土壤中的AMF 種類多樣，通常以球囊霉屬真菌為主，并伴有無梗囊霉屬、類孢囊霉屬、巨孢囊霉屬、盾巨孢囊霉屬和多孢囊霉屬等。而在本研究涉及的4 個球場“生境”中，均是以球囊霉屬真菌作為AMF 群落的優勢屬，部分足球場以無梗囊霉屬或盾巨孢囊霉屬為次優勢屬。考慮到土著AMF 在對植物的促生作用方面的優越性，選用由草坪原有的優勢AMF 為主構成的菌劑應當能獲得更好的效果。

比起單一菌種，使用由不同種的AMF 構成的混合菌劑有可能獲得更高的菌根侵染率，與宿主植物之間形成更為穩定的共生關系，并對草坪的快速建植和抗逆性能等起到促進作用［29］。綜合多方研究結果，為使AMF 菌肥發揮出最佳效果，建議以球囊霉屬真菌、無梗囊霉屬和盾巨孢囊霉屬作為主要的菌種組成，以達到更高的侵染率，從而輔助水肥營養的保持，增強‘蘭引3 號’結縷草草坪的抗性，減少養護投入。但球囊霉屬不同種的混合真菌菌劑的坪床水肥保持效應仍是一個有待研究的課題。需要在進行AMF 分子測序的基礎上，通過識別出草坪中具體的AMF 優勢種并進行擴繁，進一步探究不同菌種的組合對于草坪的水肥保持效應，指導草坪AMF 菌劑的實際生產。

4 結論

草坪養護管理強度影響‘蘭引3 號’結縷草根際土壤和根內AMF 的多樣性，管理強度較低時，根際土壤和根內AMF 的多樣性都較高，幫助‘蘭引3 號’結縷草維持自身的生長發育。而球囊霉屬真菌可以作為‘蘭引3 號’結縷草草坪AMF 菌劑的主要菌種資源，由球囊霉屬真菌為主構成的混合真菌菌劑有望成為一種安全、有效且經濟的草坪養護材料，為‘蘭引3 號’結縷草足球場草坪保水、保肥等技術的發展提供保障。