蘭州地區白三葉根瘤菌分離鑒定與篩選

蘭曉君，金艷麗，姚拓，周恒，張建貴，李昌寧，楊曉玫，陳建綱

（甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中?美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

白三葉（Trifolium repens）又名車軸草、白花三葉草、荷蘭翹搖等，原產于歐洲、北非和亞洲西部等，是豆科車軸草屬的重要牧草，因其建植成本低、產量高、品質優、適應性強（抗熱抗寒性強，可在酸性土壤中旺盛生長，也可在砂質土中生長，在我國各地均有種植。除飼用外，還廣泛用作城市綠化、綠肥、蜜源和藥材等［1］。蘭州地區白三葉主要用于城市綠化，綠期長達250 d［2］。

根瘤菌在氮限制條件下，與特定宿主植物形成共生關系，在宿主根部誘導根瘤的形成［3］。在根瘤中，來自大氣的氮轉化為氨，然后被氨化為氨基酸、核苷酸和其他細胞成分，宿主植物以根瘤菌固定的氨作為氮源，并為根瘤菌提供了碳源，因此根瘤菌與其宿主植物共生是互惠互利，在農業以及地球氮循環中都具有重要意義。

早前研究報道從白三葉根瘤中分離到的根瘤菌種有豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）、安徽根瘤菌（R. anhuiense）、高盧根瘤菌（R. gallicum），葡萄牙根瘤菌（R. lusitanum）、蠶豆根瘤菌（R. fabae）、R.laguerreae、放射根瘤菌（R. radiobacter）、洪特拉根瘤菌（R. huantiense）、蒙古根瘤菌（R. mongolense）、R.phaseoli、苜蓿 中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）、Burkholderia phytofirmans、Burkholderiales bacterium和中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）的菌種［4］，但有確切文獻報道能與白三葉結瘤固氮的只有豌豆根瘤菌（R. leguminosarum）的菌株［5-7］，因此有必要研究和發現新的誘發白三葉結瘤固氮的根瘤菌種類和結瘤固氮能力突出的菌株。

本研究從蘭州市黃河邊綠化帶種植的白三葉根瘤中分離出疑似根瘤菌菌株，通過形態學、生理生化和16S rRNA 序列分析及構建系統進化樹鑒定根瘤菌的種類，通過沙培法回接進行結瘤試驗，測定對照及接種不同根瘤菌株白三葉的結瘤情況、生物量及營養指標，明確使蘭州白三葉結瘤固氮的根瘤菌種類，篩選高效的白三葉共生根瘤菌菌株，為制作白三葉根瘤菌菌肥收集菌種資源。

1 材料和方法

1.1 樣本的采集與處理

2016年9月從甘肅省蘭州市北濱河路邊綠化帶（N36°09'67.6" N，E 103°69'89.3"），選擇生長健壯的白三葉植株，從其根部收集粉色、飽滿的根瘤，裝入樣品袋內，4 ℃運至實驗室。同時收集白三葉的種子，以供回接試驗使用。

1.2 培養基

基礎培養基（YMA）：10 g 甘露醇，0.5 g 酵母粉，0.3 g 磷酸氫二鉀，0.2 g 無水硫酸鎂，0.1 g 氯化鈉，18 g 瓊脂粉，1 升雙蒸水，pH 值7.0［8］。

篩選培養基（YMA 剛果紅培養基）：YMA 培養基滅菌后，1 L 加入過濾滅菌的0.25%的剛果紅溶液10 mL，搖勻后倒平板。

NA 培養基購自BD Difco 公司。

1.3 根瘤菌分離純化與保存

用清水將根瘤表面雜質沖洗干凈，無菌濾紙吸干水分。生物安全柜內，將根瘤樣品先后浸入75%乙醇內1 min，次氯酸鈉溶液（4%有效氯）1 min，75%乙醇1 min，無菌水沖洗6 次，第6 次沖洗后的水涂布在NA平板上進行根瘤表面滅菌效果評估；根瘤在無菌濾紙上吸干水分，取0.5 g 放置在無菌研缽內，加入4.5 mL無菌水研磨，梯度稀釋至10-3，在篩選培養基上涂布10-2和10-3稀釋液各20 μL；28 ℃培養箱培養5 d，從平板上選取沒有吸收剛果紅的圓形、凸起、質黏、邊緣整齊、略透明或半透明的典型菌落，在YMA 培養基上四區劃線分純，純化后的菌株接入YMA 培養基斜面4 ℃短期保存，試驗后有研究和應用價值的菌株與滅菌的20% 甘油溶液混勻并分裝至凍存管中-80 ℃長期保存。

1.4 菌株形態學觀察和生理生化特性檢測

純化后的菌株在YMA 培養基上28 ℃培養5 d，觀察菌落形態，使用Hucker 法檢測革蘭氏反應［9］，光學顯微鏡放大1 000 倍觀察細胞形態，用壓滴法觀察細菌運動性。菌株接種在YMA 培養基上，分別在4、8、10、16、20、25、30、35、40、42、45 和50 ℃條件下培養10 d 以檢測菌株的溫度耐受范圍；調整YMA 液體培養基，使該培養基氯化鈉的含量分別為0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%和2%，接入100 μL待測菌液振蕩培養10 d（200 r/min，28 ℃），測定氯化鈉耐受范圍；pH 耐受試驗是在基礎培養基中加入如下的緩沖液：pH 值5.0，HAC?NaAC；pH 值6.0，NaOH?KH2PO4；pH 值7.0，NaOH?KH2PO4；pH 值8.0，NaOH?KH2PO4；pH 值9.0，Borax?Boric acid；pH 值10.0，Bo?rax?NaOH；pH 值11.0，Na2HPO4?NaOH；28 ℃振蕩培養（200 r/min），每2 天觀察1 次［10］。氧化酶、接觸酶、淀粉水解、纖維素分解、需氧性測定、碳源利用、氮源利用和檸檬酸鹽利用等生化和生理指標檢測參考《常見細菌系統鑒定手冊》描述的方法［11］。

1.5 菌株16S rRNA 擴增與系統進化分析

使用細菌基因組DNA 提取試劑盒（北京艾萊德生物科技有限公司）提取細菌基因組DNA，使用細菌16S rRNA 通 用 引 物：27F（5′?GAGTTTGATCCT GGCTCAG ? 3′）和1492r（5′-TACGGCTACCT TGTTACGACTT?3′）進 行 擴 增，PCR 擴 增 條 件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃∞；擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測 序 結 果 在EzBioCloud 網 站（https：//www. ezbio?cloud.net/）與NCBI 的Genbank 數據庫中的模式菌株序列比對分析，并獲取序列相近模式菌株的16S rRNA 序列，使用MEGA7.0 軟件，鄰近法構建系統進化樹，自展值為1 000［12-15］。

1.6 根瘤菌回接試驗

以石英砂（滅菌）為基質裝入塑料杯后放入盛有Hoagland 無氮營養液的容器中，選取飽滿的白三葉種子用75%的乙醇和次氯酸鈉（4%有效氯）表面滅菌，將滅菌后的種子放置在底部鋪有無菌濾紙的培養皿內，26 ℃培養至發芽，后移栽至塑料杯內，每杯10 株。待長出3 片真葉后接種濃度為108cfu/mL 的根瘤菌菌液，以加無菌液為對照，45 d 后檢測植株結瘤情況。

1.7 菌株接種效果測定

接種根瘤菌菌液45 d 后測定植株結瘤數、株高、每株地上部分鮮重和干重、粗蛋白、粗脂肪和粗纖維含量等指標；粗蛋白含量采用凱氏定氮法，粗脂肪含量采用索氏脂肪提取器提取法，粗纖維含量采用酸性洗滌劑法［16-17］。

1.8 根瘤固氮酶活性測定

將剪下的根瘤稱重后置于10 mL 的西林瓶內，硅膠塞封口后用注射器從瓶內抽出1 mL 氣體再注入1 mL 純乙炔氣體，1 h 后采用乙炔還原法測定固氮酶活性［18］，每個樣本3 次重復。

1.9 統計分析

使用SPSS 19.0 統計軟件對回接試驗數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 細菌形態與生理生化特征

本研究共分離到疑似根瘤菌菌株6 株，編號為GAU?00001~GAU?00006。6 株菌株之間形態學與生理生化特性差別不大。pH 耐受范圍：菌株GAU?00001 和GAU?00006 略寬于其余菌株；菌株GAU?00006 能夠利用D?果糖和丙酮酸鹽為唯一碳源，而其他菌株不能；所有菌株都表現出一定的耐鹽特性（能夠在氯化鈉含量≤1%的培養基中生長）。菌株具體特性見表1。

表1 菌株的形態學與生理生化特性Table 1 Morphological and physiological and biochemical characteristics of strains

2.2 菌株16S rRNA 序列系統進化分析

分離的6 株疑似根瘤菌16S rRNA 序列之間相似性大于99.9%，這些序列在EzBiocloud 網站中與NCBI 數據庫中模式菌株比對結果顯示與R. an?huiense、R. laguerreae、R. leguminosarum和R. sopho?rae的相似性最高（99.77%~99.92%），臨近法構建的系統進化樹（圖1）顯示6 株疑似根瘤菌聚類在一起與R. anhuiense、R. laguerreae、R. leguminosarum和R. so?phorae構成一個分支，表明這6 株疑似根瘤菌是根瘤菌屬的成員。

圖1 6 個菌株與其相關根瘤菌屬模式菌株16S rRNA 序列基于鄰近法構建的系統進化樹Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16SrRNA gene sequences showing the relationships among six strains and closely related species of the genusRhizobium

2.3 回接試驗

接種菌株GAU?00001、GAU?00002、GAU?00005和GAU?00006 的白三葉根系結瘤，對照（CK）及接種菌株GAU?00005 和GAU?00006 的植株根系沒有結瘤（表2）。

2.4 菌株接種效果測定

接種菌株GAU?00001、GAU?00002、GAU?00005和GAU?00006 的白三葉根系根瘤檢測出固氮酶活性，4 個菌株接種后形成的根瘤數量沒有明顯差異，但根瘤的固氮酶活性表現為接種GAU?00001 和GAU?00006 的明顯高于接種GAU?00002 和GAU?00005；接種 菌 株GAU?00001、GAU?00002、GAU?00005 和GAU?00006 的植株其株高、鮮重、干重、粗纖維和粗脂肪含量之間沒有明顯差異，但優于對照和接種GAU?00003 和GAU?00004 的植株；接種菌株GAU?00001 和GAU?00006 的植株粗蛋白含量明顯高于對照組接種其他根瘤菌株（表2）。

表2 根瘤菌回接試驗測定指標Table 2 Experimental data of the white clove inoculated the stains GAU-00001 to GAU-00006

3 討論

本研究從白三葉根瘤內所分離的6 株菌，菌落形態表現為凸起、質黏、乳白色、半透明、在YMA 剛果紅培養基上生長不吸收剛果紅，符合典型根瘤菌的菌落特征；另外16S rRNA 測序結果與根瘤菌屬的模式菌株相似性最高，且與R. anhuiense、R. laguerreae、R. le?guminosarum和R.sophorae共同構成一個分支（圖1），說明6 株菌株屬于根瘤菌屬，但由于6 株菌株和4 株模式菌的任何一株都沒有形成單獨的分支，因此不能確定這6 株菌是4 個模式菌株中的哪一個種；以系統進化分析而言，這6 株菌株更可能構成一個單獨的分類單元。16S rRNA 雖然是細菌進化的分子鐘，但畢竟信息量有限（1 600 bp），對于部分細菌分類無法明確到種的水平，雖然有研究表明一些看家基因（RecN，GyrB，rpoB，SodA，ThrC，DnaK和GroEL等）能夠對種水平的鑒定有所幫助，但精準的鑒定更有賴于全基因組雜交來證實。

4 種模式根瘤菌中，只有R.leguminosarum能使白三葉結瘤固氮［19］，沒有R. sophorae與R. anhuiense不能使白三葉結瘤［20-21］，R. laguerreae能否使白三葉結瘤固氮的報道，因此根瘤菌與宿主結瘤固氮的專一性是某種根瘤菌自身的重要特性但不是鑒別根瘤菌種的必要特性；此外文獻報道R. sophorae能使菜豆（Phaseolus vulgaris）和苦參（Sophoraflavescens）結瘤固氮［20］，R. laguerreae被證實能使蠶豆（Vicia faba）結瘤固氮［22］，R. anhuiense能使豌豆（Pisumsativum）和蠶豆結瘤固氮［21］，因此本研究所分離的菌株有使菜豆、苦參、蠶豆和豌豆這4 種豆科植物結瘤的可能，有必要進一步的研究以確定這6 株根瘤菌的宿主范圍。

菌 株GAU?00001、GAU?00002、GAU?00005 和GAU?00006 使白三葉結瘤且所結根瘤檢測出固氮酶活性，對應植株的生理特征、生物量和營養成分含量也優于對照和接種GAU?00003 和GAU?00004 的植株；菌株GAU?00001 和GAU?00006 所誘導產生的根瘤固氮酶活性高于菌株GAU?00002 和GAU?00005，對應植株的粗蛋白含量也表現出同樣的特點。因此菌株GAU?00001 和GAU?00006 表現出優良根瘤菌的特性。從接種的總體效果來看，本研究中接種根瘤菌的植株與CK 相比，株高、鮮重、干重和部分營養指標差異顯著，與前人的研究一致［5］。對于菌株GAU?00003 和GAU?00004 沒有與白三葉識別并結瘤固氮，可能的原因是這兩株根瘤菌缺失相關的共生基因或者共生基因發生突變而導致無法合成或分泌結瘤因子與白三葉根部分泌的信號分子相互識別，但這一推測有待于進一步的研究論證。

4 結論

（1）從蘭州白三葉根瘤內分離的6 株根瘤菌均鑒定為Rhizobiumsp.

（2）菌株GAU?00001 和GAU?00006 為可使白三葉結瘤固氮的優良高效根瘤菌菌株，可用于白三葉菌肥的生產。