包容 高建峰 饒艷

肺結核是由結核分枝桿菌或結核分枝桿菌復合群的其他菌株感染引起的傳染性疾病，其在臨床病理上分為多種類型；但實驗性肺結核病變與臨床肺結核不完全相同。因為菌株、接種、動物品系、病程等諸多因素不同，實驗性肺結核的病變呈現出自身的特點。目前，實驗性肺結核病理分型缺乏一致的認識，有的分類比較粗略、主觀性強。如有文獻按由重到輕的順序將病變程度分為3類[1]；但這種分類不是很準確，如結核性肺炎，雖病變面積廣、病變重，卻歸于次重組。也有按照病變輕重和性質分類，如把肉芽腫類型由重到輕分為3型[2]；或者按照結節大小、數量、性質等因素把病變類型分為4類[3]；或將病變由輕到重分為5類[4]；還有文獻把肺結核病變分為纖維化、結節、壞死等6種類型[5]；但這些分類方法均隨意性比較強，且缺乏具體病理病變類型，分類方法不夠細致全面。本文闡述了實驗性肺結核病灶發生發展的過程，并全面總結了實驗性肺結核的各種病變類型，這有利于提升對實驗性結核病變的認知，有助于對實驗性肺結核病變程度的評估，有利于抗結核藥物與結核疫苗的有效性評價。

一、實驗性肺結核動物模型

在用于結核病臨床前研究的動物中，使用最多的動物是小鼠，超過60%；其次是豚鼠，接近25%；再次是兔子，超過10%；其他如非人靈長類(non-human primate，NHP)等很少[6]。在用于結核疫苗評價的動物中，使用最多的動物也是小鼠，其次是豚鼠、牛，兔、猴、羊較少。大小鼠、豚鼠和NHP對結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)敏感，而牛和兔對牛分枝桿菌(M.bovis)敏感，且小鼠因個體小、費用低而有明顯優勢。因此，兔、大鼠和豚鼠都適合抗結核藥物與疫苗的研究，而小鼠特別適合大規模藥物與疫苗篩選[7]。小鼠作為實驗動物也被認為有不足之處，因為小鼠不是MTB的自然宿主；而空洞作為肺結核的一個重要指標，也沒有在常見的兩個小鼠品系中被觀察到[8]。豚鼠在感染時表現出敏感的免疫反應，是抗結核疫苗評價的良好模型。猴結核模型具有與患者相似的臨床癥狀和典型的肉芽腫結構，是疾病機制研究的重點[9]。

自然途徑感染動物模型受到關注。低劑量MTB氣溶膠途徑的感染模型能更好地模擬臨床肺結核發病的經過，被認為是與人類自然感染過程更接近的動物模型[10]。隨著硬件設施設備的提升，高菌落形成單位(CFU)感染模型或者靜脈途徑感染逐漸被低CFU氣溶膠途徑感染模型取代。

潛伏感染模型也受到關注。為了探索治療性疫苗的有效性，減少潛伏感染者化療藥物的使用，需要一個動物模型來評價疫苗對MTB的破壞力。這個模型傾向于使用低的感染劑量和相對不敏感的動物，如在小動物中選擇小鼠，或者在NHP中選擇食蟹猴。

NHP動物使用逐漸增多。這是因為從免疫反應與藥物反應看，NHP與人類更接近，所以相關研究結果可以與臨床研究進行比較。這些NHP主要是食蟹獼猴(食蟹猴)和普通獼猴(恒河猴)。恒河猴對MTB敏感，容易出現嚴重病例和死亡。食蟹猴對MTB相對有抗性，因此也是潛伏感染模型的選擇對象之一。

高分辨率CT(HRCT)、PET/CT、FDG-PET/CT和核磁共振(MRI)已經應用于動物實驗。這些技術可以對病灶進行三維重建，評估病灶大小、性質與位置，從而更精確的評估病變程度。

二、結核性病灶的發生與發展

臨床上，結核病灶標本的病變比較典型或者相對嚴重，但感染極早期的變化卻很難見到；不過我們可以通過動物實驗再現這一過程。這與普通細菌感染的極早期表現有類似之處，開始僅表現為血管周圍炎(perivasculitis/periangitis)或者細/小支氣管周圍炎(peribronchiolitis)。血管與細/小支氣管周圍的淋巴細胞浸潤是結核性結節形成前的病變。在MTB感染后，淋巴細胞較早在細/小支氣管和血管周圍聚集，形成周圍炎(圖1、2)。這在實驗性肺結核中較常見[11-14]。這種病變也在病毒感染的動物模型中可見，如小鼠新冠病毒感染[15]。

圖1、2 C57BL/c小鼠MTB標準菌株H37Rv氣溶膠感染后極早期的周圍炎(肺組織切片；HE染色：×100)。圖1為小血管周圍炎表現。圖2為細支氣管周圍炎表現 圖3 C57BL/c小鼠MTB感染后肺組織切片(HE染色：×200)：細胞性結核結節，結節中可見大量泡沫狀巨噬細胞

周圍炎繼續擴大可形成單個或多個以淋巴細胞為主的小結節[13-14, 16]。巨噬細胞也會進入病灶周圍的肺泡內并吞噬病原菌，逐漸形成胖大的泡沫狀巨噬細胞(foamy macrophage, FM)[14,16-18](圖3)。細胞性結節中的巨噬細胞表現為上皮樣巨噬細胞[19-20]或上皮樣細胞[21-23]。推測肺泡中的FM會逐漸失去泡沫狀特征而成為上皮樣巨噬細胞，并最終成為上皮樣細胞。這些成分共同構成或大或小的結節病灶[24]。被巨噬細胞浸潤的肺泡逐漸與周圍炎病灶形成小結節[14]，小結節逐漸形成大結節，大結節則融合成片[25]。結節在擴張的過程中會逐漸將含大量淋巴細胞的周圍炎病灶包裹進去，大的細胞性結節可包含多個周圍炎病灶[2]。

三、實驗性肺結核的病變類型

實驗性肺結核的病變類型包括結節性和非結節性病灶(如周圍炎、結核性肺炎、間質性肺炎)。又根據其病灶性質分為以下類型：(1)壞死性病灶：膿性結節、干酪性結節、結核性肺炎、肺膿腫；(2)實性病灶：細胞性結節、纖維性結節、混合性結節；(3)肺間質病變：包括間質性肺炎和肺間質纖維化；(4)其他：如周圍炎、肺水腫、肺充血、肺氣腫等。

(一)結節性病灶

結節性病灶有多種，包括實性細胞性、壞死性、膿性、纖維性結節等。

1.細胞性結節：細胞性結節屬于增生為主的病變，其病變發生較早，易在小鼠模型[1]中發現。因為實驗的菌株、攻毒、免疫等諸多因素的不同，病變也有較大差異[26]。細胞性結節包括淋巴細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、肺泡上皮細胞、多核巨細胞等多種成分，以前三種為主。早期的結節主要由淋巴細胞構成[13]，多種表型的淋巴細胞參與了細胞性結節的構成[14, 27]；隨后巨噬細胞逐漸增多，與淋巴細胞相互混雜[17]。典型的細胞性結節[5, 19]的中心由密集的上皮樣巨噬細胞或上皮樣細胞組成[21, 25]，結節邊緣可有多核巨細胞[28]，結節外圍常見淋巴細胞[20, 25]。也有部分病灶的肺間質明顯增寬而無明顯結節化，滲出也不明顯，周邊組織無明顯炎性細胞浸潤，使得肺組織形成疏松多孔結構或不規則病灶[29]，殘存少數大的含氣肺泡。細胞性結節性病灶為多中心性，小結節邊緣逐漸向外延伸并相互連接，逐漸融合成大結節。大結節進一步發生片狀融合、中心壞死、外周纖維化或實變，或急性進展為結核性肺炎。

2.干酪性結節：干酪樣變是MTB感染的特征性病變，也是最常見的病變類型。干酪化意味著比較嚴重的炎癥反應。多個細胞性結節相互融合，中央壞死后逐漸形成干酪化病灶。

在壞死病灶早期，MTB較多，巨噬細胞因吞噬過多的MTB，抗酸桿菌染色呈紅色[3]。有些干酪化壞死區外也有一圈FM包繞[30]，其形態與結節形成初期肺泡中的FM不同；后者形態圓潤而飽滿，類似氣球。這些FM呈橢圓形，脂質溶解后外觀空亮(圖4)，免疫組化染色可見其分布與表型[12]。也有很多壞死的結節僅有成纖維細胞、淋巴細胞包裹[12, 31]，這些環繞的淋巴細胞被稱為淋巴細胞套(lymphoid mantle)[2, 18]或淋巴細胞圈層(lymphocytic rim)[31]。這些外圍的纖維化成分有助于炎癥的控制，如果病灶局限化，則病情相對穩定。

圖4 小鼠肺組織切片(HE染色：×200)：干酪樣壞死性結節(右)外圍有一層富脂質的梭形巨噬細胞包繞，其細胞透亮，最外層可見淋巴細胞套

多種實驗動物的肺結核可出現干酪樣壞死，如絨猴[32]、食蟹猴[5, 33-34]。病變輕的肺葉僅有少數綠豆大或者更小的結節，呈切面干酪樣；而全肺實變的肺結核壞死灶的切面也可呈干酪樣。這種病灶在其他動物中也可見，如羊[31]、豚鼠[35]等。有文獻認為小鼠肺結核不形成干酪樣壞死灶[36]，但實際上這在C57[3]、C3H小鼠[1, 30, 37]中也可見。另外，多種分枝桿菌感染可以引起小鼠干酪化病變，包括MTB Erdman 株[1, 37]和H37Rv株[38]、多重耐藥株[33]，甚至鳥分枝桿菌(M.avium)[3]等。

3.膿性結節(suppurative granuloma)與膿腫(abscess)：膿性結節這個概念可能會引起爭議，其實膿性結節在臨床中較常見，如淋巴結核。與固化的干酪樣壞死不同，膿性結節包含液化壞死的膿性物質，主要是死亡的炎性細胞，特別是中性粒細胞碎片。結節中膿性成分很少，但膿腫不同。病肺的肺葉還可有巨大膿腫形成，特別是對MTB敏感的恒河猴[28](圖5)或者在攻毒劑量大的情況下。肺部病灶發生液化性壞死時，常合并胸膜粘連，切開粘連后可見膿性液體，質地濕稠，而非干性或干酪樣。有這類病灶的實驗猴往往因為呼吸衰竭而瀕臨死亡。膿腫可見于肺、支氣管組織，還可見于肝臟；但最常見的是淋巴結，特別是縱隔淋巴結、肺門淋巴結，這可能與中性粒細胞反應有關。

圖5 中國恒河猴支氣管途徑MTB Erdman株感染。大體解剖，右肺切開可見巨大膿腫形成

結節性病灶還可能含有一種以上的成分，或者兼具某種過渡類型的特征[25]，如同時含有壞死組織和細胞成分；有的結節性病灶則帶有明顯的纖維化成分[13, 39]，也有以膠原成分為主的結節性病灶[5]，但較少見。

圖6～8 C57BL/c小鼠感染MTB后的結核性肺炎壞死性病灶與抗酸染色。圖6為結核性肺炎肺組織切片HE染色(×40)：結核結節可見明顯的壞死灶，結節外可見大片炎性滲出病灶。圖7、8為肺組織切片抗酸染色(×400)，圖7可見大量紫紅色抗酸桿菌，圖8可見少數抗酸桿菌

(二)非結節性病灶

1.結核性肺炎(tuberculous pneumonia)：結核性肺炎并未被常規列為肺結核的病理類型，是結核性炎癥擴散引起的，并不屬于結節性病變，而是比單純的干酪性病變更嚴重的病變類型。該類病變變態反應劇烈，病灶面積廣，進展迅速，易導致實驗動物死亡。大面積的壞死與滲出并存是結核性肺炎的重要特征。鏡下可見多個相連的干酪樣壞死區域，呈地圖樣改變，同時壞死區周邊肺泡可見滲出[5](圖6)。這類病變可見于小鼠[40]，如 H37Rv[41]或Erdman株[1, 30]感染的C3HeB/FeJ小鼠、免疫缺陷小鼠[42]等；這類病變更常見于NHP的肺結核動物模型[5, 32]。因此，結核性肺炎是NHP實驗中比較常見的病變類型，特別是在動物MTB敏感或者MTB攻毒劑量大的情況下[5]，而并非Flynn認為的屬于偶爾出現的病變[39]。

結核性肺炎期或者急性期，在充滿滲出液和細胞的肺泡中可見大量的抗酸桿菌(圖7)， 隨著壞死、纖維化、結節化的進程，菌量明顯減少；在壞死時間較長或者完全壞死的組織中，甚至見不到典型的抗酸桿菌，而在邊緣的纖維化區域，也僅僅有數個典型的MTB(圖8)。

2.間質性肺炎(interstitial pneumonia，ILD)：又稱肺間質纖維化(pulmonary fibrosis)或彌漫性實質性肺疾病。間質性肺炎因為長期的肺組織損傷引起細胞外基質的沉積，膠原組織替代正常肺組織，導致肺泡壁增厚、變硬[43]，并非普遍認同的結核病變類型，但部分文獻認為肺纖維化屬于肺結核的病變后果[43-44]，結核病研究大家Flynn也將“間質纖維化”列為肺結核的病變類型[5,39,45-46]。

小鼠實驗性肺結核均可見不同程度的間質性肺炎(圖9)，C57BL/6小鼠的病變表現為肺間質巨噬細胞、淋巴細胞浸潤和肺間質纖維化[2]或者肺間質彌漫性增寬[38]，這也被稱為彌漫性肉芽腫肺炎[47]，鏡下可見類似模式小鼠的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)[48-49]；也有更嚴重的肺間質纖維化和肺實變[50]。C3HeB/FeJ小鼠在接種Erdman菌株后肺間質發生纖維化并伴壞死[1]。Balb/c小鼠在H37Rv感染后可見廣泛的滲出和肺間質淋巴細胞浸潤[35]或者很重的間質性肺炎[47]。

圖9 小鼠間質性肺炎肺組織切片HE染色(×200)：可見肺間質增寬，并有淋巴細胞浸潤，巨噬細胞增生間質性肺炎

NHP的MTB感染可出現壞死性病灶伴肺間質明顯增寬[33, 51]，類似病毒性肺炎[34]。其他實驗動物如大鼠[16]、兔[52]、山羊[31]和豚鼠[53]的MTB感染也可出現間質性肺炎。

值得注意的是，某些“間質性肺炎”[54]是由解剖或取材時肺組織受到外力擠壓，肺泡內空氣被排出而形成的，所以可能會導致誤判。由于缺乏結節性病灶，間質性肺炎的病變程度評分較困難，但肺相對質量和肺浮重可以作為評價指標。與結節性病灶不一樣，間質性肺炎的病灶不會明顯局限化，其嚴重程度取決于殘存肺泡的數量與肺間質寬度。如果合并其他病灶，如肺內占位性病變，則動物容易出現呼吸困難。

圖10～12 C57BL/c小鼠感染MTB后實驗性肺結核的其他肺結核病變類型。 圖10為肺組織切片(HE染色：×200)，可見肺組織結節旁的代償性肺氣腫，結核結節旁有部分肺泡破裂，融合。圖11為肺組織切片(HE染色：×100)，可見廣泛性肺充血伴局灶性肺水腫。圖12為肺組織切片(HE染色：×200)，可見結節旁廣泛性肺水腫

3.鏡下的空洞與鈣化：有文獻指出，MTB實驗性感染也會出現鈣化與空洞，包括MTB、M.bovis感染的各種實驗動物[36]；也有文獻指出恒河猴和食蟹猴都會形成結核空洞，但不一定出現鈣化與干酪化[55]；但諸多文獻證實多種動物包括食蟹猴[5]、兔[52]、豚鼠[14]、山羊[31]的肺結核都有鈣化與空洞形成。還有文獻認為兔、豚鼠、猴肺結核都能發生空洞和鈣化，而小鼠肺結核不形成空洞，一般也不形成干酪樣病灶[56]；這意味著小鼠模型不能模擬人肺結核的全部病變類型，模型有一定缺陷。稍后的研究發現，小鼠肺結核也有明顯的大的空洞形成，如C3HeB/FeJ、CBA/J小鼠[2]。盡管空洞與鈣化被認為是很重要的標志，但從大體解剖與鏡下診斷看，實驗性肺結核的鈣化[39]與空洞都屬于不常見的病變類型。

實驗性肺結核的干酪化壞死物被吸收后收縮，形成空洞，而濃縮的壞死物則形成鈣化灶，呈現空洞與鈣化并存的現象，是同一病變的多種表現形式；鈣化在未完全形成時空洞特征不明顯。實驗性肺結核的空洞與鈣化的病灶比較小，且空洞非開放性，這與臨床肺結核不同。組織切面的結節中間有圓形空缺，有可能是細/小支氣管的橫截面，不一定是結核性空洞。隨著化療藥物的發展，肺結核的臨床結核病變類型已經發生了很大的變化，過去常見且嚴重的病變類型如纖維空洞型、干酪樣肺炎已經變得很罕見，所以糾結于是否形成空洞與鈣化或許已沒有現實意義。另外，因為動物倫理和福利等原因，現在也很難通過動物模型復制與人類結核病相似的空洞性肺結核動物模型。

4.其他類型的病變：除以上病變外，肺結核還可伴有其他病理改變，如周圍炎、肺水腫(滲出)、肺充血、肺氣腫、支氣管炎、鈣化/空洞。其中，肺氣腫、肺水腫、肺充血等這些并不是特征性病變，所以可能會被忽略或者回避。

(1)代償性肺氣腫：是肺結核的繼發性病變。長期嚴重的咳嗽可引起肺泡過度擴張或者部分肺組織實變后出現代償性肺氣腫。鏡下可見猴肺泡擴大，并伴有肺泡壁破壞、肺泡融合、肺間質增寬、肺泡過度充氣等[28]；這在小鼠中也可見[38](圖10)。另外，肺氣腫常伴隨纖維化改變[28]。(2)肺充血：是因為炎癥反應，使小血管增粗，結核病灶周圍可見明顯廣泛的肺充血[1,38]，或肺組織中炎性細胞增多并出現明顯的充血[57]，或充血伴水腫[58](圖11)。(3)肺水腫：是肺組織炎性滲出，HE染色見肺泡內充滿粉紅色物質，為滲出的蛋白。在小鼠感染的各階段肺組織局部均可發現肺水腫[29]。恒河猴在減毒株感染后也可見廣泛性肺水腫[54](圖12)。這種滲出可以是一過性的，肺部滲出液會逐漸吸收，從而使缺氧得到緩解；如果范圍過大，動物可能因此缺氧而死亡。(4)支氣管病變：細/小支氣管周圍炎繼續進展為細小支氣管炎，周圍組織的壞死過程也會波及細小支氣管[59]；膿性或者干酪樣壞死物可能會突破小支氣管壁，進入管腔，或者堵塞支氣管[60]。MTB感染還可以引發淋巴管炎[14, 59]。

結核結節只是肺結核的典型病變，而不是肺結核的唯一病變類型。除了常見的壞死性、細胞性、纖維性、混合性結節外，結核性肺炎也屬于肺結核的病變類型。另外，本文還將血管周圍炎、細/小支氣管周圍炎、間質性肺炎、(代償性)肺氣腫、肺水腫、肺膿腫、肺充血、支氣管炎等列為肺結核的病變類型。

四、病變類型與時間進展

病變類型和病變程度與多種因素有關，如動物品系、菌株類型、接種劑量、干預因素以及病程等。病變因動物品系而有所差異，如C3H小鼠病變比Balb/c小鼠嚴重[41]；如大鼠對MTB不敏感，慢性期病灶會逐漸縮小[16]。

一般情況下病變會進行性加重，也有病變逆轉的報告。敏感動物感染后病灶會逐漸進展，隨感染時間延長，病變面積逐漸增加，病灶占肺組織比例逐漸升高；結節逐漸增大，增多；如M.bovis感染山羊[31]和CBA/J小鼠[25]。干預因素處理組病變也有類似的趨勢，只是進展相對緩慢[29]；但也有相反的情況，如疫苗組小鼠后期比前期病變更輕[47]?？赡艿脑蚴?，在干預因素作用下細菌數量得到有效控制，肺泡中的滲出被吸收，炎性細胞浸潤減少，病灶縮小。

病變與時間進程并不一致，同一時間可以出現多種病變類型或者同一種病變類型可以在不同時間出現。如小鼠肺組織病變從結構松散的小結節或者到出現泡沫狀細胞，時間從幾周到幾個月都有可能[17-18]；如C3H小鼠在感染后的1～2個月內出現幾種不同病變程度與類型的病灶，包括以壞死為主的結節、結核性肺炎以及細胞性結節病灶[1]；如豚鼠的鈣化灶可以在感染后6周內、 60 d后[14]或者29周后發生[36]。

另外，病變也與感染劑量有關，菌量過低時，病變進展緩慢，表現為彌散的、結構松散的結節病灶；而高劑量組的壞死性病變則會更早出現，也更容易出現結核性肺炎。

五、病變程度的評分

肺結核病變程度的評價有多種方法。包括大體解剖評分、組織病理學評價、臟器指數(肺相對質量)、肺浮重(密度)、免疫組化染色等[61]。大體解剖是最直觀的方法，正常的肺組織取出后會因為失血而顏色變淺，而病肺因為炎性病灶而顏色變深，且質地與質量取決于病變程度；組織病理學評價可以明確病變類型、病灶數量、病變面積；大體解剖與組織病理學具體評分方法見文獻[61]。臟器指數與肺浮重可以量化肺損傷的程度。大動物可以通過稱量肺浮重和臟器指數評價肺部炎癥的程度，因為滲出或者壞死、纖維化等組織實變，肺相對質量(肺指數)會有增加。所有動物的肺指數都可以通過稱量得出，而肺浮重只有較大的動物才容易測量。免疫組化染色可以判斷免疫細胞亞群和分布范圍以及浸潤程度等。

六、藥物和疫苗的有效性評價

抗結核藥物與疫苗有效性評價的方法包括組織的細菌載量、病理評分、免疫應答強度和影像學檢測等。

細菌載量是常用方法之一，可以量化評價藥物或疫苗效果；細菌載量同時也是非?？陀^的指標。細菌載量與病變程度有相關性，但相關程度并不是非常高；所以有必要結合其他方法來評價?？顾崛旧彩且环N直觀的方法，其壞死組織的結核分枝桿菌形態不典型，很難判斷，不能反映病變后期組織中的菌量，所以應用受到一定限制。

病理評分是病變程度的量化，雖然有一定的主觀性；但不失為最直接、最準確的評價方法。病理評分包括大體解剖的評分和細胞病理學評分。大體解剖評分的參數包括病變的體積與數量；細胞病理學評分的參數包括多種細胞類型或者病變類型。肺相對質量(肺指數)與肺浮重(肺密度)也是病變大體評價方法的一種。肺指數適合大小不同的動物，而肺浮重僅適合大動物；小動物肺太小而難以計算體積。

疫苗效果的預測常用到免疫學參數，包括特異性抗體滴度和細胞免疫應答強度，如CD4+T細胞和CD8+CLT細胞或者其他免疫細胞比例等。酶聯免疫斑點測試(Elispot)是另外一種檢測細胞免疫的方法，可以反映分泌特異性干擾素(IFN-γ)的效應性T細胞數量。

核磁共振(MRI)和各種類型的CT等影像學方法也逐漸應用于結核動物實驗，這不僅可以量化病變的體積大小與病灶的數量，還可以更客觀、更直觀地動態觀察病變進展，有別于傳統的檢測方法。但這些儀器只是在少數實驗室中被使用，暫時難以普及。

另外，生存時間、死亡率等也都可以作為評價的指標。

總之，結核性病變是復雜的。血管周圍炎、細/小支氣管周圍炎、結核性肺炎、間質性肺炎都是實驗性肺結核的表現形式。全面認識實驗性肺結核的病變形態，并認識到結核病變的多樣性，對結核動物模型的構建、抗結核藥物與疫苗的研發，以及臨床診斷結核病有著非常重要的意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻包容：負責課題設計，查閱文獻，撰寫論文；高建峰：負責文章修改與潤色；饒艷：負責文章修改，審核，并最后定稿