利用前景與背景選擇技術進行節水抗旱稻加值育種

劉 毅,孔德艷,王飛名,張安寧,劉國蘭,余新橋,羅利軍

(上海市農業生物基因中心,上海 201106)

高產和穩產是作物育種最基本和最重要的目標。在水資源日益短缺、耕地面積減少、氣候變化帶來的非生物和生物脅迫愈加嚴重的不利影響下,提高和穩定作物產量是育種面臨的嚴峻挑戰。近年來,包括持久的抗病蟲害能力、非生物脅迫耐受性以及養分和水分利用效率等與產量穩定性和可持續性相關性狀的改良越來越受到廣泛的關注[1-3]。

然而,上述性狀大多為數量性狀,在DNA分子標記技術出現之前,快速發現微效多基因控制的復雜數量性狀位點(QTL)是極其困難的[4]。分子標記技術促進了作物遺傳學的發展,DNA標記能夠檢測潛在性狀基因的等位變異,為作物遺傳育種提供了便利。分子標記輔助選擇(Marker-assisted selection,MAS),是指利用與目的基因緊密連鎖的分子標記或共分離的功能標記,對個體的目標基因進行檢測,從而在群體中篩選獲得期望的個體,是一種將分子標記應用于作物育種的輔助選擇手段,可以大大提高育種效率和精度[5]。全基因組選擇是指在利用分子標記對目標基因進行選擇的同時,也利用分布于全基因組的與目標基因非連鎖的分子標記對遺傳背景進行選擇,從而實現對目標基因和遺傳背景的共同選擇,達到定向改良目標性狀目的[6]。分子標記在質量性狀和主效QTL,如抗病蟲基因滲入、聚合等方面展現出很高的效率。節水抗旱稻是通過水旱稻雜交,結合在目標環境強脅迫條件下篩選培育的既具有水稻的高產優質,又具有旱稻的節水抗旱特性的一種新的栽培稻類型,在節水抗旱的遺傳背景下,利用分子標記輔助技術,增添其他有價值綠色性狀的加值育種,為選育少打農藥、少施化肥、節水抗旱、優質高產的綠色超級稻提供了可行、有效的途徑。本研究主要介紹利用分子標記前景和背景選擇技術進行節水抗旱稻加值育種的研究進展,總結加值育種過程中的經驗,并對今后需要關注的關鍵性狀和方向進行展望。

1 分子標記

DNA分子標記是揭示突變∕變異的DNA片段,可用于檢測群體或基因庫中特定DNA序列的不同基因類型或等位基因之間的多態性。在分子標記輔助選擇育種中,有效使用的理想DNA標記應具備以下標準:(1)多態性強;(2)在全基因組均勻分布(不是在特定區域集中);(3)共顯性(可以區分純合和雜合);(4)不同等位基因的特征容易辨別;(5)單拷貝;(6)使用成本低,便于分析和高通量自動化。目前作物遺傳育種中應用比較廣泛的是基于PCR檢測的SSR(Simple sequence repeat)和SNP(Simple nucleotide polymorphisms)標記[7-8]。

2 分子標記輔助回交育種

分子標記輔助回交育種(Marker-assisted backcrossing,MABC)是MAS主要應用之一,目的是在不改變受體遺傳背景的情況下,將一個或多個有利基因從一個品系(供體)導入到另一個品系(受體)。主要選擇過程為:(1)選擇一個綜合表現較好、部分性狀待改良的親本作為受體,攜帶目標基因的親本作為供體,受體和供體雜交;(2)利用目標基因的分子標記檢測雜合基因型F1代,并與輪回親本回交;(3)在BC1F1群體繼續利用分子標記檢測,選擇目標基因雜合的單株與輪回親本回交,根據實際需求可連續回交3—4代。(4)在BC4F2群體中,利用分子標記篩選目標基因純合單株,自交收種進行下一步評價。

分子標記輔助回交的效率取決于許多因素,包括每個回交世代群體的大小、分子標記與目標基因的遺傳距離以及使用標記的數量等,傳統回交育種恢復到輪回親本99%的遺傳背景可能需要6—8代,結合分子標記的前景選擇、重組選擇、背景選擇,標記輔助回交育種僅需要3—4代,可以極大加速回交計劃[9-10]。

2.1 前景選擇

前景選擇是基于分子標記檢測結果,選擇攜帶供體目標基因的個體,以確保基因在雜交和回交過程不會丟失,并且在自交階段以純合的形式固定下來。前景選擇最早由Tanksley等[11]提出,可以在作物苗期階段進行標記檢測,以便選擇最合適的單株進行回交,對表型篩選過程費力或耗時的性狀特別有用。

2.2 重組選擇

重組選擇的目的是減少含有目標基因的供體基因組片段的大小。在回交過程中,與其他染色體相比,攜帶目標基因的染色體上的輪回親本基因組恢復得更慢,因為很難打破與目標基因連鎖的供體基因組片段。特別是當這些連鎖區段存在控制不良農藝性狀的基因時,會帶來一些連鎖累贅的問題。需要選擇使用位于目標基因兩側的標記,在至少兩個回交世代檢測重組的發生,最終獲得在兩個側翼標記上是受體等位基因,而在目標基因座上具有供體等位基因的個體[26]。

2.3 背景選擇

背景選擇是借助標記信息對受體的遺傳背景進行選擇,以加快受體遺傳背景的恢復速度。在背景選擇中所用到的標記是與目標基因不連鎖的,除目標基因外,其他所有標記盡可能選擇受體親本的基因型,受體基因組恢復的進展取決于所用標記數量,標記數量越多,恢復的速度越快,但是需要更大的群體規模和更多的基因分型[8]。

近年來,利用水稻抗病蟲和米質相關的前景選擇標記(表1),筆者團隊以節水抗旱稻主要親本為受體,以攜帶不同抗性基因的種質資源為供體,通過分子標記輔助選擇和常規育種相結合的手段,創制了一批富含綠色性狀的新種質[27]。安正帥等[28]利用分子標記輔助回交育種的方式,將稻瘟病抗性基因(Pi1,Pi2和Pi9)導入節水抗旱稻保持系滬旱1B和恢復系旱恢3號中,稻瘟病抗性鑒定結果表明,攜帶抗性基因的改良株系抗病性顯著高于其輪回親本。劉毅等[29]利用白葉枯病抗性基因Xa23來改良節水抗旱稻親本滬旱1B的抗性,獲得了白葉枯病抗性顯著提高的改良保持系及其不育系。張安寧等[30]將褐飛虱抗性基因Bph6、Bph9、Bph14和Bph15單獨或聚合的方式導入到節水抗旱稻親本旱恢3號中,獲得了一系列含有1—4個褐飛虱抗性基因的改良株系,并對這些改良株系進行效應評價,結果表明:多基因聚合改良株系抗性優于單基因改良系,Bph9的褐飛虱抗性最強。通過分子標記輔助選擇、常規雜交結合在目標環境高強度脅迫篩選,Liu等[31]將廣譜抗稻瘟病基因Pi9、Pi54和Pi5導入到節水抗旱兩系不育系滬旱1S中,獲得一個新的節水抗旱稻光溫敏核不育系滬旱74S,14個稻瘟病菌的人工接種鑒定表明:滬旱74S抗性頻率為85.7%,在田間自然誘發條件下,滬旱74S及其雜交組合對苗瘟和穗頸瘟也表現出較好的抗性。Liu等[15]根據軟米基因Wxhp基因第4外顯子第77位堿基A∕G的SNP突變位點設計開發了特異引物,可以準確進行基因型鑒定,利用軟米基因Wxhp可在改良南方秈稻品種食味品質方面發揮重要作用。

表1 抗性基因前景選擇標記Table 1 Foreground selection markers for resistance genes

3 全基因組分子標記背景選擇育種

隨著測序技術的發展和檢測成本的降低,在全基因組范圍內進行背景選擇成為可能。通過基因組測序,可以獲得大量的SNP標記,實現對基因組的高密度覆蓋,顯著提高選擇的準確性,在全基因組選擇育種中具有廣泛的應用前景[32]。Wing等[33]提出利用基因組育種技術培育綠色超級稻的策略。基因組育種包括兩個組成部分:基因組設計和全基因組選擇?；蚪M設計是以特定的優良品種為受體或底盤親本,設計在目標區域種植所需要的性狀以及這些性狀涉及到的基因∕標記,然后收集包含這些目標基因的種質資源作為供體,確定組裝這些基因并將其導入底盤品種中的技術路線。全基因組選擇包括基因分型平臺和基因特異性選擇系統,分別對目標基因和基因組背景進行選擇?；蚍中推脚_采用的是育種芯片,利用大規模重測序項目和水稻功能基因組研究成果,已經開發設計制作了3款水稻SNP基因芯片(RICE6K、RICE60K、RICE90K),分別有4 500個、4.3萬個、8.5萬個高質量SNP標記位點數目[34-36]?；趯碜匀?9個國家和地區的3 024份水稻樣品進行全基因組重測序的信息,華智生物技術有限公司與中國農業科學院合作開發了水稻56 K高密度SNP芯片,包含約5.6萬個SNP標記,其中4 700多個SNP標記與已知的2 300多個水稻功能基因緊密連鎖。隨著基因型檢測技術的發展,基于靶向測序基因型檢測的液相芯片技術更加靈活,成本更低,同一套標記可以通過控制測序深度,應對不同標記密度的檢測要求[37]?；蛱禺愋赃x擇系統包括選擇目標基因的功能標記和每個目標基因兩個側翼用來檢測供體和受體基因組之間重組的DNA標記,便于選擇目標基因已被精確導入的品系。

種植多系品種可以提高作物群體的遺傳多樣性,是一種控制病蟲害的生態學方法。Zhu等[38]提出將具有相似背景的抗病(80%—90%)和感病(10%—20%)品種混合種植可有效減少稻瘟病新生理小種的形成,制約稻瘟病菌的快速變異,延長水稻抗病品種的使用年限。利用分子標記前景和全基因組背景策略進行多系品種選育有兩個優點:一是提高了效率,純合改良系在3年基本可以獲得,而傳統常規育種方法需要5—6年;二是除了能將抗性基因準確導入受體親本,減少遺傳累贅,獲得遺傳背景基本一致、農藝性狀相似、攜帶不同抗性基因的近等基因系,為作物獲得持久抗性提供了一種思路。此外,不同性狀的基因可以很容易地通過一個雜交組合成一個同質的遺傳背景。因此,可以通過將多個基因整合到一個單獨的品系中來培育多抗綠色超級稻品種[33]。節水抗旱稻雜交組合‘旱優73’是目前長三角推廣面積最大的品種,由不育系滬旱7A和恢復系旱恢3號選育而來[39]。筆者團隊采用全基因組背景選擇育種的方法,將不同稻瘟病抗性基因(Pi2、Pi9、Pigm)、白葉枯病抗性基因(xa5、Xa21、Xa23)、褐飛虱抗性基因(Bph6、Bph9、Bph14)分別導入到恢復系旱恢3號中,在雜交和回交過程利用目標基因的分子標記進行前景選擇;在BC1F1和BC2F1個體中,利用SNP芯片進行全基因組背景分析,篩選輪回親本背景回復率最高的個體進行回交;在BC3F1個體中,利用48對SSR標記[40]進行背景檢測,選擇48對SSR標記差異最小的單株自交收種;在BC3F2群體中,利用目標基因分子標記和差異SSR標記作為前景選擇標記,篩選目標基因純合且差異SSR標記與輪回親本一致的個體自交收種,進行下一步抗旱性和農藝性狀評價。在構建單個抗性基因的等基因系時,在不同的回交世代,可以根據需要選擇相應目標基因的個體雜交進行不同抗性基因的聚合(圖1)。經過這樣的選擇方式,獲得了平均遺傳背景與旱恢3號相似性為97.5%的近等基因系和三基因聚合系,這些改良系及與不育系滬旱7A配制的組合農藝性狀基本一致,為提高節水抗旱稻品種抗病蟲能力,延長品種生命周期提供了可行的技術手段。

圖1 分子標記前景和背景選擇進行加值育種Fig.1 Molecular marker foreground and background selection for value-added breeding

4 基于分子標記輔助選擇的節水抗旱稻加值育種

節水抗旱是綠色超級稻重要的性狀之一,然而,植物的抗旱性是極其復雜的,受到多基因控制和環境影響。盡管尋找抗旱基因并將其應用于育種實踐一直是一個熱門的研究課題,但到目前為止,利用這些基因培育抗旱品種并將其應用于實踐的報道還很少。實際上,正如Pennisi[41]指出,在基因組學揭示的大量候選抗旱基因中,幾乎在田間旱脅迫條件下很難有表型。這是因為抗旱性是一個復雜的性狀,受到數千個抗旱基因及其與環境的交互作用的影響[42-43]?？购档男纬墒嵌鄠€抗旱基因相互作用的系統網絡的結果,而不是單個抗旱基因的結果。為此,許多研究者提出了一種聚合不同抗旱機制基因的育種策略[44-45],節水抗旱稻即通過常規育種方法導入旱稻的避旱基因和水稻的耐旱基因而選育而成。經過20多年的努力,目前已經成功培育了20多個節水抗旱稻新品種,這些新品種在我國旱地和灌溉生態系統中都有種植,部分在亞洲和非洲各國示范種植表現良好,在中國累計推廣面積超過百萬公頃[46]。筆者團隊利用分子標記輔助選擇,將抗病蟲基因導入到節水抗旱稻親本中,獲得了抗性顯著提高的改良親本,表明以節水抗旱稻為底盤品種,利用分子標記前景選擇和背景選擇,是選育綠色超級稻一種有效的途徑。

Wei等[47-48]研究表明,常規雜交結合在目標環境高強度脅迫選擇下,大量的干旱適應和抗旱轉錄調控網絡中的基因被保留并聚集在育種后代的基因組中。依據這個育種策略,筆者利用分子標記前景選擇將3個抗稻瘟病基因通過雜交的方式導入節水抗旱稻親本滬旱1S中,在確定3個抗性基因純合的前提下,進行避旱性、耐旱性、產量及品質性狀的交替篩選,新育的光溫敏核不育系滬旱74S抗旱性與滬旱1S一致,抗病性顯著提高,驗證了分子標記結合逆境脅迫選擇的高效性[31]。在育種實踐中發現,在同類抗性基因聚合中,存在明顯的加性效應,多基因聚合的改良系抗性水平高于單基因導入系,對稻瘟病抗性基因而言,Pi2、Pi9、Pi25、Pigm在多個節水抗旱稻親本(秈或者粳)遺傳背景下均表現出廣譜的抗性;對于白葉枯病抗性基因,抗性效應是xa5＞Xa23＞Xa21,xa5基因兼具抗細菌性條斑病,但由于是隱性抗性基因,適合在常規稻抗白葉枯病改良中利用[49-50]?？购诛w虱單基因的抗性效應是Bph9＞Bph6＞Bph15＞Bph14,但聚合兩個抗性基因以上的改良系的結實率低于受體親本[30]。為了減少遺傳累贅,利用全基因組選擇恢復受體遺傳背景,加快回交育種進程,獲得了3個不同類型抗病蟲基因(Pi9、Bph6和Xa23)聚合的改良系,背景回復率高達97.5%,綜合農藝性狀與輪回親本保持一致,無明顯差異,但稻瘟病、褐飛虱和白葉枯抗性水平顯著高于輪回親本,達到了精準定向改良的目的(圖1)。

5 展望

以節水抗旱稻為代表的綠色超級稻的成功推廣應用,在生產上大面積實現了“資源節約、環境友好”的綠色農業生產目標。節水抗旱稻加值育種的目標是在保留抗旱性的遺傳背景下,選育多抗、優質、適應輕簡化栽培的新種質,培育綠色低碳的節水抗旱稻新品種。第一,利用分子標記輔助選擇,創制了富含抗病蟲基因的節水抗旱稻新種質和育種中間材料,以此為供體可以大大減少直接從地方種質資源或野生稻中利用這些抗性基因的難度和時間。在加值育種過程中,除了通過回交和背景選擇盡可能保持節水抗旱的遺傳背景,分離世代還是應該堅持在沒有犁底層的旱地(山地)選擇避旱性,在水分脅迫的旱田選擇耐旱性,在灌溉的水田選擇高產性狀,通過交替篩選整合不同的抗旱機制。第二,加值育種應注重稻米品質特別是優良食味、營養功能等性狀的改良,提高稻米的經濟價值,滿足人們對美好生活的向往以及特殊人群的需求。第三,加強耐鹽堿、高光效等性狀的篩選和利用,進一步拓展節水抗旱稻品種應用面積和區域,保障糧食安全。第四,關注適應輕簡化栽培的性狀,如低氧萌發、早生快長、抗除草劑、抗倒伏等有利等位基因,推廣直播旱管、低碳環保的種植模式。第五,利用基因組編輯技術實現目標性狀的快速精準改良。第六,陸稻在旱作馴化中受到雙向選擇,蘊藏豐富的節水抗旱、養分高效、易栽培等綠色遺傳資源,加強對陸稻基因資源的挖掘和利用,解析重要基因資源的分子機制,并在此基礎上創制科學、高效、可行的分子設計育種方案。