水稻抗旱相關基因OsDR1的克隆、鑒定及表達分析

周立國,劉灶長,孔德艷,徐 凱,夏 輝,吳金紅,羅利軍

(上海市農業生物基因中心,上海 201106)

當前,我國農業用水占總淡水用量的70.4%,而水稻用水占農業用水的70%[1],而另一方面,我國淡水資源相對缺乏、分布不均,人均淡水占有量不到世界平均水平的1∕4,提高淡水資源的利用效率是必然選擇[2]。上海市農業生物基因中心充分發掘利用陸稻資源,將其抗逆性導入水稻中,成功育成了以‘旱優73’‘WDR48’‘旱兩優8200’等為代表的兼具水稻高產優質特性和旱稻節水抗旱特性的栽培稻品種新類型——節水抗旱稻(Water-saving and drought-resistance rice,WDR)。與傳統水稻品種相比,WDR品種可節約50%以上淡水資源,在有效提高水稻水分利用效率的同時也保持了水稻高產優質特性,具有重要的社會意義和經濟意義[3]。但是,目前關于水稻等農作物的節水抗旱機制缺乏系統性的研究,已有研究多集中在單個基因抗旱性能方面,無法在實際育種和大田生產中應用。

生物節律性包括近年生物鐘、季節生物鐘、近月生物鐘和晝夜生物鐘等,受長時期的環境影響而形成,又一定程度上獨立于環境短時變化,依據內在基因震蕩得到維持[4]。各生物中均有形成、維持、輸出節律性功能的機制和基因,生物各生長發育過程都受到生物鐘的影響[5-7]。依靠內在生物鐘,植物對干旱缺水、光照等環境條件的響應具有一定前置性,故可快速響應干旱等非生物逆境脅迫[8-11]。

鹵酸脫鹵素酶(Haloacid Dehalogenase,HAD)參與生物節律性調控過程。鹵酸脫鹵素酶最初是在細菌中被發現并得名的,其廣泛存在于動物、植物等真核生物及藍細菌、鉤端螺旋體等原核生物中[12]。含HAD結構域的蛋白質的整體序列相似性很小,這些蛋白質包含4個保守的序列基序[13-14],其中的帽子結構是由3個短的催化基序組成的核心催化結構域。根據帽子結構域的位置、結構以及折疊方式等的差異,可以將其劃分為多個亞家族。大多數HAD蛋白參與磷酸基轉移,包括磷酸酶、P型ATP酶、磷酸酯酶和磷酸轉移酶[15],但是因HAD結構域蛋白氨基酸序列的多樣性,各蛋白功能也復雜多樣。在水稻中已鑒定出40種典型的HAD蛋白,還有更多的HAD類似結構蛋白未被鑒定出來[16]。HAD蛋白質的水解底物不同,植物中的HAD酶可分為蛋白磷酸酶、小分子磷酸酶、脫鹵酶、磷酸酯酶和β-磷酸葡萄糖變位酶等,參與多種新陳代謝過程[17-18]。HAD家族蛋白還有可能與生物的晝夜節律響應有關,果蠅中的DREG-2蛋白擁有HAD類似的結構,具有磷酸酶活性,屬于天冬氨酸-親核水解酶亞家族即HAD1A家族,參與果蠅晝夜節律的生理調控[19-20]。

‘IRAT109’是優異陸稻資源,綜合抗旱性強,包含眾多的抗旱基因資源,同時也是諸多節水抗旱稻的骨干親本。本研究通過干旱脅迫處理水稻‘IRAT109’篩選到干旱相關基因OsDR1,通過監測其表達特征分析其與水稻干旱脅迫的關系,旨在為水稻抗旱育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用旱稻品種‘IRAT109’(Oryza sativaL.ssp.japonica)進行轉錄譜分析和基因克隆,‘湘晴’(Oryza sativaL.ssp.japonica)為遺傳轉化的受體材料。大腸桿菌菌株為E.coliDH5α,農桿菌菌株為EHA105,所用載體見表1。

表1 載體信息Table 1 Vectors information

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻非生物逆境脅迫及激素處理

挑選健康飽滿的‘IRAT109’種子,在正常水分管理條件下用1∕2濃度水稻培養液(參考國際水稻研究所營養液配方)培養至4葉期。

低溫脅迫:把幼苗放入4℃光照培養箱,分別在處理0 h、0.5 h、1 h、3 h、20 h時取幼苗葉片。鹽脅迫是分別將幼苗由水培液移入250 mmol∕L、500 mmol∕L NaCl水溶液中;甘露醇滲透脅迫是分別將幼苗由水培液移入100 mmol∕L、200 mmol∕L、500 mmol∕L甘露醇水溶液中;激素處理是分別將水稻苗根部浸入到含50μmol∕L、150μmol∕L脫落酸(ABA),100μmol∕L、200μmol∕L過氧化氫(H2O2),50μmol∕L、150μmol∕L甲基茉莉酸(Me-JA),0.5 mmol∕L、1.5 mmol∕L水楊酸(salicylic acid,SA)等培養液中;室溫培養,并在處理0 h、1 h、2 h后取葉片樣品。

1.2.2 苗期水稻在不同的光照及水分條件處理

水稻‘IRAT109’種子播入裝滿泥土的小桶中,正常水分條件下培養到4葉期,設置下列3種處理:自然光照下進行干旱處理(土壤含水量低于15%),自然斷水直至植株開始出現卷葉;在正常水分條件下避光培養,取樣檢測前避光一個晝夜(24 h);對照處理,即自然光照下正常水分管理。取樣時使用照度計測量光照強度,每個處理分別取3個生物重復樣品。

1.2.3 Total RNA提取

RNA提取試劑為Trozol A+total RNA reagent(Invitrogen),試驗方法參照試劑說明書。

1.2.4 實時定量PCR

實時定量PCR(qPCR)所用試劑為SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time),所用儀器為Applied Biosystems 7000 Real-Time PCR System。利用引物qDR1f和qDR1r,擴增OsDR1基因,片段長度為133 bp。以水稻Actin2基因為內參。引物信息詳見表2。在基因擴增效率基本一致的情況下,利用相對定量的方法計算目標基因的相對表達量變化[21-22]。

1.3 RACE方法克隆目的基因

使用BD SMART RACE cDNA Amplification Kit,運用cDNA末端快速擴增法(5’-and 3’-rapid amplification of cDNA ends,RACE)獲得OsDR1基因全長cDNA序列。以干旱處理后的苗期‘IRAT109’總RNA為模板,利用含有oligo dT(16)和特異接頭序列的反轉錄引物逆轉錄獲得cDNA。在反轉錄過程中加入5’RACE接頭,MMLV反轉錄酶識別完整mRNA的帽子結構并將5’RACE接頭轉移到cDNA的5’末端,從而獲得5’末端含有帽子結構和特異序列、3’末端含有oligo dT的完整cDNA。以上述cDNA為PCR模版,分別以3GSP1、3GSP2為基因特異引物,和3’RACE通用引物配對,進行兩輪PCR擴增,將所得片斷測序,獲得包含DR1基因mRNA PolyA尾巴的3’端序列。分別以5GSP1、5GSP2為基因特異引物,和5’RACE通用引物配對,進行兩輪擴增,通過克隆、測序,獲得包含帽子結構的5’端序列。將所得的3’及5’端序列拼接,得到完整的OsDR1基因全長序列。引物信息詳見表2。

表2 所用引物及序列Table 2 The primers and sequences

1.4 載體構建及遺傳轉化

利用末端含有內切酶識別序列的引物對D1f-BamHI∕D1r-SacI擴增OsDR1基因全長編碼序列。用BamHI及SacI內切酶切除PCR片段和pBI121載體;用T4連接酶將OsDR1全長片斷與之連接,替換GUS片斷。用HindIII和EcoR I從pBI121-DR1載體內切下,并且瓊脂糖凝膠電泳分離CaMV35S:DR1片段,連接到pCAMBIA1300多克隆位點相應位置,構成pCAMB1300:35S:DR1植物轉化載體。將載體轉入大腸桿菌DH5α,提取質粒,冰凍法轉入農桿菌EHA105,采用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化水稻‘湘晴’的愈傷組織。

1.5 轉基因水稻田間抗旱表型鑒定

轉基因水稻按照大田播種要求催芽播種,苗床上長至4葉期后移植到轉基因抗旱大棚內種植。株行距為15 cm×15 cm,每株系種植4行,每行6穴,每穴1株,重復3次。正常水分管理下生長至6葉期開始斷水,約15 d后即在8葉期形成干旱脅迫,記錄水稻植株表型。

2 結果與分析

2.1 OsDR1基因cDNA全長序列及蛋白結構分析

根據干旱脅迫下基因表達芯片結果[23],對比水、旱環境下陸稻‘IRAT109’苗期葉片中差異表達基因,篩選到水稻抗旱相關基因(DT-relative gene)OsDR1,其在干旱條件下表達量顯著提高,比正常水分下增加了近3倍。但該基因的翻譯起始密碼和終止密碼序列未知,故通過RACE的方法得到了含有翻譯起始密碼子的5’端序列以及含有翻譯終止密碼子和poly A尾巴的3’端序列,拼接后獲得了這一干旱相關基因全長的cDNA序列,其長度為902 bp,包含有完整的基因編碼區(圖1A)。將序列提交到NCBI數據庫(Genbank:DQ103591),通過BLAST(https:∕∕blast.ncbi.nlm.nih.gov∕Blast.cgi)比對,發現OsDR1基因對應的基因號為LOC_Os07g46520.1;其對應的染色體DNA序列長度為2 892 bp,包含6個外顯子和5個內含子。

圖1 OsDR1基因全長cDNA序列和編碼氨基酸序列及HAD功能域示意圖Fig.1 The cDNA and amino acids sequence with HAD domain of OsDR1 gene

根據OsDR1基因cDNA序列推導出其編碼氨基酸序列(圖1B)。OsDR1氨基酸序列包含一個HAD結構域,其中3個短催化核心保守區域構成帽子結構(圖1C)。HAD結構域具有一定序列保守性,廣泛存在于細菌、動物、植物等原核及真核生物中。通過BLAST比對發現OsDR1蛋白具有鹵酸脫鹵素酶類似功能域[19-20],歸屬于鹵酸脫鹵素水解酶超級蛋白家族,具有磷酰基轉移酶活性。在Gramene數據庫(http:∕∕www.gramene.org)中比對,其注釋顯示,OsDR1蛋白具有磷酸甘油磷酸酯酶活性,催化磷酸甘油磷酸基團的水解,促進甘油的積累,是乙醛酸和草酰乙酸代謝途徑的關鍵酶類。

根據RACE測序及拼接結果,設計帶有內切酶識別位點的基因特異擴增引物D1f-BamHI和D1r-SacI(表2),以‘IRAT109’cDNA為模板進行PCR擴增,擴增片段大小為892 bp(圖2),包含完整的氨基酸編碼區。經過測序和序列比對,擴增片段序列與RACE測序及拼接結果相同。

圖2 PCR擴增克隆到的OsDR1片段Fig.2 Cloning of OsDR1

2.2 OsDR1基因受非生物逆境誘導表達

在4℃低溫條件下苗期水稻OsDR1基因被誘導上升表達,3 h時表達量最大,隨著處理時間的延長,OsDR1基因表達量開始下降(圖3A)。在不同濃度甘露醇模擬干旱處理下,OsDR1基因上升表達,并且隨著處理時間的增加,表達量也在增加;表達變化趨勢與甘露醇的濃度無明顯相關性;但是過高濃度、過長時間的甘露醇脅迫處理會降低OsDR1基因的上調表達(圖3B)。圖3C顯示,OsDR1基因對鹽脅迫也有反應,較長時間鹽脅迫會誘導基因上升表達。綜上,OsDR1基因表達受模擬干旱脅迫的誘導而呈現明顯的上調表達趨勢。

圖3 逆境下苗期水稻地上部OsDR1相對表達量變化Fig.3 Relative expression of OsDR1 under water-stress at 4-leaves stage of rice

以qPCR方法檢測OsDR1基因在經ABA、H2O2、JA、SA等激素處理的‘IRAT109’苗期植株中的表達情況。結果顯示,低濃度的ABA對OsDR1基因表達的影響不明顯,而高濃度ABA會在短時間內(1 h)上調OsDR1基因表達量(圖4A);較長時間高濃度的H2O2處理會顯著提高OsDR1基因表達(圖4B);JA在能較短時間內誘導OsDR1基因上調表達,隨后(2 h)回落到處理前水平(圖4C);長時間高濃度的SA處理誘導OsDR1基因明顯上調表達(圖4D)。由此可知,OsDR1基因的表達受到ABA、H2O2、JA、SA激素的誘導而上調表達,其中,對長時間高濃度H2O2處理響應最顯著。

圖4 水稻苗期施加植物激素后OsDR1相對表達量變化Fig.4 Relative expression of OsDR1 with plant hormones treatment at 4-leaf stage of rice

2.3 OsDR1基因呈節律性表達并受干旱脅迫誘導

根據實際測量結果,上海8月份4:00左右自然光照強度開始增加;6:00左右太陽升起,光照強度迅速增加。qPCR結果顯示,在對照條件下(正常水分、自然光照)、干旱脅迫處理、遮光處理等3種不同環境條件下,水稻中OsDR1基因的表達豐度在一天中的整體變化趨勢相同,即在4:00之后自然光照強度開始增加時迅速上升,6:00日出時到達最高點,之后隨著光照強度增加而明顯下降。由圖5可知,首先,干旱處理下OsDR1基因表達量顯著上調表達。正常光照條件下,干旱處理與正常水分下OsDR1基因mRNA表達最高值無顯著差異。正常水分條件下水稻中OsDR1基因在6:00達到最高點,之后迅速下降,12:00到達最低水平;干旱脅迫誘導下,OsDR1基因表達長時間處于較高水平,直到12:00過后才開始迅速下降。即干旱延長了OsDR1基因高豐度表達的時間,使其總表達量顯著增加。其次,在黑暗的條件下,水稻OsDR1基因的表達仍然呈現明顯的與自然光照下相同的變化趨勢,具有光誘導的節律表達特征。綜上,OsDR1基因表達響應外界光照條件的變化而呈現節律性,并且受水稻本身的內在節律性機制調控。

圖5 不同條件下OsDR1基因在水稻中的表達Fig.5 OsDR1 mRNA expression abundance under different conditions

2.4 轉基因植株獲得與陽性植株鑒定

轉基因植株DNA經HindIII酶充分酶切,通過PCR擴增(Hptf、Hptr引物詳見表2)獲得抗潮霉素基因DNA片段,將其作為southern雜交的探針,檢測T-DNA整合到T0代水稻基因組中的情況。從圖6可知,轉基因植株中均含T-DNA片段,其中3個株系只有1個拷貝,其他陽性植株含有2—3個拷貝;同時還檢測到3個陰性轉基因植株,可用作后續試驗的陰性對照。

圖6 OsDR1轉基因T0植株的Southern blot分析Fig.6 Southern blot analysis of OsDR1 transgenic T0 plants

2.5 OsDR1基因增強水稻抗旱性

由圖7可知,干旱脅迫條件下轉基因陽性植株(KR215、KR117)生長狀況良好,葉片挺拔、葉色嫩綠,植株生長量大;相比較下,轉基因陰性植株在干旱脅迫下出現了葉片卷曲、干枯,葉色發白,植株生長受抑制等情況。表明水稻中超表達OsDR1基因改善了植株在水分缺乏情況下的生存狀況,提高了對干旱脅迫的耐受性。

圖7 超表達OsDR1基因水稻的抗旱表現Fig.7 Drought resistance performance of OsDR1 over-expression rice plant

3 討論

3.1 OsDR1基因參與干旱等非生物逆境脅迫響應過程

在水稻苗期進行脫落酸(ABA)、茉莉酸、水楊酸和過氧化氫,以及甘露醇、鹽、低溫等非生物逆境脅迫,均能提高OsDR1基因在葉片中的表達。其中ABA介導的信號傳遞途徑是植物非生物脅迫信號傳遞的核心途徑,可以調控產生H2O2,控制氣孔開閉,調控植物對干旱脅迫的響應[24-26]。OsDR1基因對ABA和H2O2處理都有響應,自然斷水干旱及模擬干旱脅迫下水稻OsDR1基因表達量均顯著上調,據此推斷,OsDR1基因通過ABA和H2O2信號途徑,參與水稻的干旱脅迫響應機制。

3.2 OsDR1蛋白分子功能分析預測

根據蛋白序列特征分析,OsDR1與DREG-2蛋白均屬于鹵酸脫鹵素酶家族的HAD1A亞家族;實時定量分析結果顯示,OsDR1基因的表達特征與果蠅DREG-2基因類似,均具有節律性。由此推測,OsDR1基因參與生物的晝夜節律調控[19-20]。

3.3 OsDR1基因增強水稻抗旱性的作用途徑

水稻等植物抗旱性研究多是在實驗室可控條件下,采用PEG等模擬干旱條件,或者小桶土培干旱脅迫等方式,在幼苗期、開花期等植物某一生長階段進行抗性鑒定。其優點是簡單、方便,試驗結果穩定,但結果不能代表植物尤其是作物在田間的抗旱表現。本研究于抗旱大棚中通過自然斷水產生干旱脅迫進行抗性鑒定,試驗結果更能反應植株真實抗旱表現。本研究表明OsDR1基因具有大田環境條件下增強水稻抗旱性的潛在應用價值。

光照強度會影響植物的生長和發育,過強的光照破壞植株光合作用和呼吸作用,產生過氧化效應,使植株質膜穩定性及能量代謝等生化過程受到破壞[17-18]。OsDR1基因表達的節律變化揭示OsDR1基因表達與晝夜交替相關,在光照強度增加初期表達豐度劇烈增強,為隨后的強光脅迫儲備蛋白。據此推測,OsDR1基因能在一定程度上減輕強光照帶來的負面效應。通過數據庫搜索發現,OsDR1蛋白是一個磷酸甘油磷酸酯酶,有研究表明利用假單胞桿菌來源的磷酸甘油磷酸酯酶轉化水稻,可提高水稻甘油含量,增強其對鹽等非生物脅迫的耐受性[27]。該蛋白還可能參與植物的乙醛酸循環,為三羧酸循環提供物質基礎,也預示其具有穩定水稻能量代謝的作用。綜上,OsDR1蛋白通過提高水稻中甘油含量以及穩定能量代謝來增強水稻耐旱性。