節(jié)水抗旱稻高通量表型組學研究平臺的建設與應用

高 歡,徐小艷?,陳韻宇,劉鴻艷,陳 亮,楊萬能,羅利軍,樓巧君??

(1上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心,上海 201106;2華中農(nóng)業(yè)大學,武漢 430070)

隨著世界人口快速增長,氣候等環(huán)境條件不斷變化,糧食生產(chǎn)面臨嚴峻挑戰(zhàn)[1]。水稻是我國的主糧之一,目前我國水稻生產(chǎn)主要面臨三個重大問題:一是水稻生產(chǎn)用水占總用水量的50%以上,而我國又是缺水大國[2];二是日益頻繁的干旱導致水稻嚴重減產(chǎn)[3];三是在田間長期保留水層的種稻方式隨著農(nóng)藥化肥施用量的增加,形成嚴重的面源污染,同時導致大量的溫室氣體甲烷排放[4]。節(jié)水抗旱稻是結(jié)合了水稻的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和旱稻的節(jié)水抗旱特性而育成的一種新的栽培稻品種類型。其栽培簡單易行,既可像水稻一樣在水田淹水栽培,又可像小麥一樣在旱地直播種植,既節(jié)能又環(huán)保。因此,發(fā)展節(jié)水抗旱稻,可改變水稻傳統(tǒng)栽培方式,是實現(xiàn)“資源節(jié)約、環(huán)境友好”農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展方式的重大需求,是今后可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的方向[5]。

近年來,隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展,上萬份水稻種質(zhì)資源的基因組和轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)完成,多個水稻抗旱相關(guān)基因的功能已得到解析,然而能真正用于種質(zhì)創(chuàng)新,有效提升品種抗旱能力的基因卻鮮有報道,主要原因是水稻抗旱性極其復雜,由于缺乏抗旱表型精準鑒定平臺,導致對基因序列信息的發(fā)掘利用不足。目前水稻表型性狀信息獲取主要依靠人工完成,存在效率低、精度差、主觀性高、誤差大和重復性差等缺點,并且有些指標需要剪取作物器官進行有損測量。因此,迫切需要建立高通量的抗旱表型平臺。與傳統(tǒng)人工表型測量相比,高通量表型平臺不僅具有高效準確等優(yōu)點,還可實現(xiàn)全生育期的無損測量,實現(xiàn)高通量表型信息并行獲取和統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫化管理與分析。

作物表型組學是系統(tǒng)研究作物或細胞在不同環(huán)境條件下所有表型的新興交叉學科,涵蓋作物多尺度、多維度的全方位表型性狀數(shù)據(jù)。在生物學和遺傳育種領(lǐng)域,表型組是指某一生物的全部性狀特征,不僅局限于農(nóng)藝性狀,還包括植株所表現(xiàn)出來的生理狀態(tài)及生化組分[6-7]。利用自動、高效的高通量表型平臺是獲取作物表型組數(shù)據(jù)的有效手段,有利于在可控環(huán)境下系統(tǒng)揭示基因組與環(huán)境等因素互作進而調(diào)控作物表型的分子機理。目前,根據(jù)應用場景的不同,高通量表型組學研究平臺可以分為溫室型及田間表型平臺兩大類[8]。溫室型表型組學設施主要采集和分析可控環(huán)境條件下植物或作物的表型信息,通過整合分析環(huán)境條件,匹配基因組學和表型組學數(shù)據(jù),最終實現(xiàn)“自動育種、智能育種”。大部分溫室型表型平臺都采用傳送式(Plant to sensor),如澳大利亞植物表型加速器和德國Julich中心表型平臺等[9]。田間表型平臺以軌道式居多(Sensor to plant),如英國洛桑實驗站的田間表型平臺,搭載了可見光、紅外、激光3D、葉綠素熒光、高光譜和CO2檢測等多個傳感器,利用一個可移動機械手臂進行數(shù)據(jù)采集,已應用于油菜和小麥等作物不同營養(yǎng)處理下相關(guān)田間表型研究[10]。

我國的表型組學設施建設起步較晚,中國科學院、中國農(nóng)業(yè)科學院和華中農(nóng)業(yè)大學等單位率先建立了一些以盆栽試驗為主的表型檢測系統(tǒng)[11]。上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心于2020年建成節(jié)水抗旱稻表型組學研究平臺(以下簡稱WDR表型平臺),其基本原則是在接近大田條件下,最大限度地實現(xiàn)水稻干旱脅迫處理,通過科學管理減少環(huán)境誤差,進而連續(xù)監(jiān)測群體的生長動態(tài)與表型變化。本研究結(jié)合國內(nèi)外水稻抗旱表型組學研究平臺建設和應用方面的進展,詳細介紹節(jié)水抗旱稻表型平臺各采集單元的技術(shù)與應用。

1 表型平臺基礎(chǔ)設施

隨著高通量表型組學技術(shù)的興起,國內(nèi)外投入運行的大型表型設施已有一百多套[11]。CropDesign(比利時Overijse)開發(fā)了第一個高通量表型分析平臺,命名為Trait Mill平臺,該平臺攜帶RGB攝像頭,可用于測量作物的生物量、植物形態(tài)和顏色等表型性狀,用于禾谷類產(chǎn)量基因及其功能研究和利用[12]。從技術(shù)開發(fā)上看,目前國際上最著名的表型平臺是德國LemnaTec公司研發(fā)的“全自動高通量植物3D成像系統(tǒng)”(Scanalyzer 3D;Automated PhenoAIxpert HT),該系統(tǒng)采用可見光成像技術(shù)、紅外熱成像技術(shù)、高光譜成像技術(shù)和熒光成像技術(shù),可對玉米、大麥等農(nóng)作物實現(xiàn)高通量表型觀測和自動分析[13]。

WDR表型平臺由溫室、抗旱鑒定島(池)和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)組成。溫室總占地4 608 m2,分6跨,單跨寬8 m,長96 m,肩高4 m,頂高6 m,實際可種植面積約2 666 m2,能同時進行40 000多株水稻植株的抗旱鑒定。按照抗旱性分類鑒定要求,溫室分成3個功能區(qū)域:(1)耐旱性鑒定區(qū):占地2跨,在30 cm的土層下鋪設了防水膜,盡量降低由根系造成的避旱性差異(圖1左);(2)綜合抗旱性鑒定區(qū):占地3跨,為保證形成土壤水分梯度,地塊兩邊建有1.2 m深的水溝,中間安裝供水系統(tǒng)(圖1中);(3)避旱性鑒定區(qū):占地400 m2,建有6個水培池,可同時進行1 296個籃子的培養(yǎng),配備營養(yǎng)液自動控制系統(tǒng)(圖1右)。

圖1 節(jié)水抗旱稻表型組學研究平臺溫室布局示意圖Fig.1 Layout of the greenhouses of the water-saving and drought-resistance rice(WDR)phenomics platform

綜合抗旱鑒定區(qū)采用土壤水分梯度抗旱鑒定島方式修建,每份材料種植成長行小區(qū),小區(qū)內(nèi)實現(xiàn)水旱對比種植(圖2)。從鑒定島中間有水一側(cè)到邊上無水一側(cè),形成連續(xù)的土壤水分梯度,從而保證水旱處理之間除了土壤含水量不同之外,其他環(huán)境條件完全一致。抗旱溫室還配備了風機和水簾,能夠較好控制棚內(nèi)的溫度和濕度。溫室內(nèi)外都配置小型氣象站,可以連續(xù)記錄試驗期間的空氣溫濕度、光照、降水量和風速等氣象指標。早在2002年和2006年,上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心已先后在上海青浦重固基地、白鶴基地,按照同樣模式設計和建設抗旱鑒定連棟大棚或玻璃溫室,多年的試驗結(jié)果證明了這種方式是進行群體旱脅迫鑒定的最理想模式之一[14,22]。

圖2 抗旱鑒定島土壤水分梯度形成示意圖Fig.2 Schematic diagram of soil water gradient development in drought resistance screening island

溫室內(nèi)耐旱性和綜合抗旱性鑒定于田塊上方進行,建設了5跨自動化表型圖像采集系統(tǒng)。系統(tǒng)的總體結(jié)構(gòu)包括智能導航車、遠程終端控制模塊、工作站、圖像采集和分析模塊。導航車上搭載了4種光學成像傳感器:RGB成像、紅外熱成像、高光譜相機和激光雷達,可以在橫向和縱向精準定位并采集水稻地上部分圖像信息;遠程終端控制模塊主要用于實現(xiàn)遠距離控制導航車精準定位和圖像采集。

完成采集后,圖像傳輸至工作站,通過分析軟件提取并轉(zhuǎn)換成相應的表型參數(shù),進一步進行抗旱性綜合評價(圖3)。

圖3 WDR表型平臺檢測示意圖Fig.3 The workflow of the WDR phenomics platform

圖4展示了WDR表型平臺4種圖像采集單元在田間的分布情況,每跨上面都有一個龍門架,所有的相機都掛載在龍門架上。龍門架加軌道組成一個智能導航車,可以帶動相機在X軸(不同小區(qū)種植的方向,圖4左圖長箭頭所指的方向)、Y軸(同一小區(qū)不同水分梯度的方向,圖4中圖長箭頭所指的方向)以及Z軸(龍門的豎直方向,用來調(diào)節(jié)相機和植株之間的高度)上精確移動,找到目標位置后進行精準掃描。

圖4 WDR表型平臺傳感器陣列Fig.4 The array of sensors in the WDR plant phenomics analysis platform

2 技術(shù)應用

2020年夏季,在抗旱鑒定島種植了一套水稻抗旱核心種質(zhì)群體共270份,每個材料設置3個生物學重復,利用該自動化表型設施開展抗旱鑒定和表型掃描。抗旱表型掃描從7月到9月,持續(xù)了近3個月,采集了幾十個TB的表型數(shù)據(jù)。試驗目標是連續(xù)無損地監(jiān)控水稻旱脅迫下的表型動態(tài)變化,挖掘新的抗旱敏感圖像特征,結(jié)合基因型挖掘關(guān)鍵抗旱基因,最終輔助抗旱育種。下面以這次試驗的數(shù)據(jù)和結(jié)果作為實例進行展示和討論。

2.1 可見光成像單元

可見光(RGB)傳感器是一種把可見光波長范圍反射信號作為檢測和圖像采集源的設備,可以拍攝含有植物大多數(shù)形態(tài)特征的圖像,獲取植物株高、生物量和顏色等表型性狀[15],因其性價比較高,在大量表型平臺中獲廣泛應用[16]。Liu等[17]使用RGB圖像估算小麥植株密度實現(xiàn)產(chǎn)量預測;Crimins等[18]通過定時成像設備采集植物表型的時間變化進程;Deery等[19]通過RGB圖像,分析植株的形態(tài)、緊湊度等參數(shù),獲取響應水分脅迫的相關(guān)信息。

WDR表型平臺每跨的龍門上裝載了3臺角度不同的RGB相機,整個平臺配置了15臺RGB相機。表1展示了利用WDR表型平臺的RGB單元可獲取的表型參數(shù)。除了形態(tài)、顏色和紋理等常規(guī)的RGB圖像特征,針對抗旱性研究的目標,本平臺RGB單元可提取的表型參數(shù)增加了卷葉程度、持綠程度和枯死葉比例等抗旱密切相關(guān)的性狀。與單臺可見光RGB相機相比,不同視角的可見光圖像可通過類似雙目視覺的方式獲取準確的株高和葉片角度等表型性狀。

表1 RGB單元檢測的表型參數(shù)Table 1 Phenotypic parameters detected by RGB camera

如圖5所示,同一個材料從中間有水一側(cè)到邊上無水一側(cè),形成連續(xù)的旱脅迫梯度,株高、生物量等呈逐漸遞減的趨勢,開花期也表現(xiàn)為逐漸延遲的趨勢。

圖5 2020年鑒定島上植株響應土壤水分梯度效應的表現(xiàn)(斷水后40 d)Fig.5 Plants’field performance responding to soil water gradient in the greenhouse in 2020(stop irrigation for 40 days)

與盆栽水稻側(cè)重于單株的圖像分割不同,田間水稻小區(qū)更關(guān)注對植株整體冠層圖像的分割,以此來計算特定區(qū)域內(nèi)植被覆蓋度、持綠性(Stay-green)等性狀。在干旱鑒定試驗中,持綠性指植株對抗干旱脅迫導致的葉片枯死的能力[20],常被用作衡量葉片抗旱能力[21]。除了持綠性以外,水稻冠層的形態(tài)學特征也能反映出水稻在干旱脅迫狀態(tài)下的表現(xiàn)。根據(jù)水稻小區(qū)的顏色、形態(tài)及紋理特征,提取出35個可見光圖像性狀。隨著水分梯度的形成,試驗區(qū)域從干到濕分成5個區(qū)塊,植株的生物量和顏色呈現(xiàn)顯著梯度變化,最左側(cè)區(qū)域土壤含水量最低,命名為脅迫組,其生物量最小、株高最低;最右側(cè)區(qū)域土壤含水量最高,命名為對照組,其生物量最大、株高最高(圖6)。

圖6 不同水分梯度下植株的可見光圖像變化Fig.6 Changes of visible light images of plants under different moisture gradients

可見光成像能較好地獲取大田小區(qū)水稻抗旱表型性狀。提取群體的脅迫組(干旱)和對照組(濕潤)的可見光表型參數(shù),共獲得35個圖像性狀,分別進行水旱成對t檢驗,其中有18個性狀表現(xiàn)出極顯著差異。表2列舉了其中水旱差異最顯著的10個圖像性狀,其中亮度分量均一指數(shù)(U_L)、綠色分量均一指數(shù)(U_G)和綠色投影面積占比(GPAR)等圖像性狀在水旱處理之間差異最為顯著,是進行抗旱研究時應重點關(guān)注的可見光表型圖像性狀。

表2 可見光表型參數(shù)水旱對比差異分析Table 2 The difference of the RGB image traits between the drought treat and the normal control

2.2 熱紅外成像單元

所有高于絕對零度(-273℃)的物體都會發(fā)出紅外輻射。紅外熱像儀利用光電設備來檢測輻射,在輻射強度與表面溫度之間建立關(guān)系模型,從而將物體發(fā)出的不可見紅外能量轉(zhuǎn)換為可見的不同顏色的熱偽彩圖像。

冠層溫度是指植物莖、葉、穗表面溫度的平均值,不僅與氣溫、地溫、光照強度、土壤濕度、空氣濕度和風速等自然條件關(guān)系密切,還與植物自身的基因型、生育期和水分狀況緊密相關(guān),在作物抗旱研究中的應用已有較多報道。劉鴻艷等[22]利用紅外測溫儀測量冠層溫度進行水稻抗旱性基因型篩選;梁銀麗等[23]研究了冬小麥在不同土壤水分條件下拔節(jié)到抽穗期的冠層溫度-氣溫差變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)作物在充分供水條件下,冠層溫度-氣溫差變化較平緩,而缺水時變化較大,因此冠層溫度-氣溫差可較合理反映土壤水分變化狀況和作物水分虧缺程度。

紅外熱成像探測能力強,作用距離遠,能持續(xù)直觀地顯示物體表面的溫度,可用于作物冠層溫度快速測量。WDR表型平臺每跨的龍門上均勻裝載了8臺紅外熱成像儀,整個平臺配置了40臺紅外成像儀,完成同一跨群體材料的紅外掃描,僅需20 min;溫室內(nèi)外小型氣象站和土壤溫濕度探頭記錄的同時期環(huán)境和氣象數(shù)據(jù)提供實時參照,可有效提高群體材料之間冠層溫度測量的穩(wěn)定性和準確性。圖7展示了熱紅外圖像的獲得過程,首先把獲取到的原始紅外圖像歸一化為像素值范圍為0—255的灰度圖,使用最大類間方差(OTSU)算法進行水稻冠層圖像分割;再用分割圖對原始紅外圖做掩膜處理,并對掩膜區(qū)域求取平均值,由此獲得該水稻冠層的平均溫度。比較發(fā)現(xiàn),同一材料的水旱處理之間冠層溫度差異顯著,旱處理區(qū)域的冠層溫度顯著高于有水區(qū)域。該結(jié)果與預期吻合,缺水會降低植物的蒸騰作用,從而減弱植物調(diào)節(jié)冠層溫度的能力。

圖7 紅外圖像處理過程Fig.7 The treating process of infrared thermal images

2.3 高光譜成像單元

高光譜成像技術(shù)是基于非常多窄波段的影像數(shù)據(jù)技術(shù),它將成像技術(shù)與光譜技術(shù)相結(jié)合,探測目標的二維幾何空間及一維光譜信息,獲取高分辨率的連續(xù)、窄波段的圖像數(shù)據(jù)。根據(jù)掃描方式,分為點掃描和線掃描:點掃描是一次獲得一個點的光譜數(shù)據(jù);線掃描是一次獲得一條線上的光譜數(shù)據(jù),它的成像設備是光譜儀和灰度相機,分辨率高,成像較快,目前應用最多。

隨著光譜和大數(shù)據(jù)分析技術(shù)的進步,高光譜在農(nóng)業(yè)方面的應用越來越普遍。通過高光譜掃描能夠有效反映植物的生理和生化參數(shù),如光合作用速率、土壤覆蓋狀況、氮狀況、水分指數(shù)和其他各種光譜反射指數(shù)(SRI),最終用于抗旱性評價[24-27]。

WDR表型平臺每跨的龍門上都裝載了1臺高光譜成像儀,整個平臺配置了5臺高光譜成像儀,完成整跨群體掃描大概需要7 h。為了避免日光的影響,高光譜的掃描一般在晚上進行。本平臺的高光譜成像儀獲取的是400—1 000 nm光譜的反射率。根據(jù)“線掃寬度×線掃數(shù)量×波段”可構(gòu)成一個三維數(shù)組,提取某個波段的圖像進行可視化分割,按照土壤水分梯度分成若干區(qū)塊,分析不同區(qū)塊的不同波段的光譜信息,分析流程見圖8。本平臺應用神經(jīng)網(wǎng)絡(U-Net)算法對高光譜圖像進行穗葉分割,分割效果較好(圖9)。在已完成試驗中,也發(fā)現(xiàn)高光譜某些波段與葉片含水量等抗旱指標高度相關(guān),可以作為抗旱篩選的有效指征,例如500 nm左右的某些波段,可以較好地區(qū)分抗旱和旱敏感材料,可作為早期抗旱性篩選的指標(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。

圖8 高光譜數(shù)據(jù)處理流程Fig.8 The treating process flow of hyperspectral data

圖9 高光譜圖像的穗葉分割Fig.9 Rice panicle and leaf splitting of hyperspectral image

2.4 激光雷達單元

激光雷達(Light detection and ranging,LiDAR),是一種主動式、通過捕獲目標的散射光,分析反射光來測量目標物體的距離,從而獲取相關(guān)目標信息的光學遙感技術(shù)[28]。它的優(yōu)點:具有極高的分辨率;抗干擾能力強;獲取的信息量豐富;可全天候工作[29]。隨著技術(shù)的發(fā)展,激光雷達已經(jīng)開始應用于作物表型組學的各個方面,通過激光雷達可獲取冠層和葉片的各種參數(shù),如植被覆蓋、高度、冠層結(jié)構(gòu)、葉面積指數(shù)和氮狀況等[30-34]。

WDR表型平臺每跨的龍門上都可裝載激光雷達,根據(jù)不同的精度設置,完成整跨群體掃描的時間約為2—4 h。激光雷達的掃描不受光照的影響,但受風速影響較大,風速較大時會引起植物搖晃,造成植株點云分析困難。本平臺在密閉的溫室內(nèi),幾乎不受風的影響,從而保證了檢測的準確性。利用本平臺激光雷達獲取的點云數(shù)據(jù)分析冠層高度,發(fā)現(xiàn)植株生長過程的冠層高度逐漸增大,至8月14日左右基本穩(wěn)定,而此時正是群體材料抽穗較為集中的時期,說明用激光雷達進行冠層高度檢測是可靠的(圖10)。除此之外,植株的冠層面積、光截獲面積、葉片夾角等重要農(nóng)藝性狀,也可通過激光雷達獲取。激光雷達可獲得的數(shù)據(jù)量遠超前面其他種類的采集設備,因此數(shù)據(jù)分析的難度較大,具體到每個性狀如何分析還在進一步摸索之中。

圖10 激光雷達檢測冠層高度Fig.10 Rice canopy height detected by LiDAR

3 結(jié)論與展望

WDR表型平臺以華中農(nóng)業(yè)大學楊萬能教授等自主研發(fā)的表型裝備為基礎(chǔ)[35],結(jié)合了抗旱鑒定溫室+自動化高通量表型檢測技術(shù),在溫室可控環(huán)境下內(nèi)建設自動化龍門軌道,裝配可見光、紅外、高光譜和激光掃描雷達等多元檢測裝備。在一個種植小區(qū)內(nèi)實現(xiàn)不同水分梯度處理,實現(xiàn)對整個群體的水分精確控制,可進行綜合抗旱性和耐旱性的全生育期表型無損動態(tài)監(jiān)測。在檢測通量上也有顯著提升,是國內(nèi)外通量最大、配備最齊全的水稻抗旱表型研究平臺。

經(jīng)過一年的預試驗證明,WDR表型平臺可獲取很多有效的與水分脅迫反應相關(guān)的圖像表型數(shù)據(jù),如溫度、冠層、生物量、葉片顏色形態(tài)等基于圖像的性狀,這點在以往不同作物研究中也有論述[36-37]。但是基于數(shù)字圖像提取水分脅迫后相應的圖像特征(i-traits),有些無法與傳統(tǒng)的水稻抗旱農(nóng)藝性狀直接對應,如何正確解讀i-traits,挖掘出真正對抗旱功能基因組研究有價值的量化性狀,是水稻抗旱表型組學發(fā)展的關(guān)鍵所在[38]。同時,由于表型采集技術(shù)的快速發(fā)展,即使只針對單個物種,全表型測量也會產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)集。在今后相當長的時間內(nèi),圖像分析及數(shù)據(jù)解析方法仍然是新一代植物表型組學發(fā)展的瓶頸[11],因此,認為只要購買了先進表型儀器就能完成整個表型組測量、數(shù)據(jù)分析和生物信息挖掘等,是對表型組學研究的誤解[39]。

抗旱表型組學作為一個“組學”的范疇,其全面分析的潛力還體現(xiàn)在其與其他組學研究的結(jié)合上[40]。表型組學可同時整合基因組、代謝組和轉(zhuǎn)錄組等多組學數(shù)據(jù),以及考慮環(huán)境和管理因素,對植物的細胞、組織、器官、個體、群體等不同尺度及不同生長發(fā)育時期進行綜合分析,全面提升作物表型精準鑒定能力,繪制作物抗旱響應完整的調(diào)控網(wǎng)絡,促進水稻育種模式和育種理念的變革,實現(xiàn)育種過程的設計性、預見性和可控性,為智能高效育種提供新的可能和思路。