水稻耐旱性及其研究進展

馬孝松,曾賢軍,李恩熙,梅捍衛,羅利軍,劉鴻艷

(農業農村部糧食作物基因資源評價利用重點實驗室,上海市農業生物基因中心,上海 201106)

氣候變化是21世紀中國乃至全球農業面臨的嚴峻挑戰之一,事關糧食安全、社會穩定和經濟發展。近年來,全球氣候變暖,干旱、高溫等自然災害頻發,對農業生產造成了嚴重的威脅。水稻是我國最重要的糧食作物,同時也是用水大戶,水稻用水量約占總用水量的50%[1]。我國是世界上13個貧水國家之一,人均淡水資源占有量為2 400 m3,僅為世界人均淡水資源占有量的1∕4。我國水稻生產正面臨著水資源短缺的危機,發掘水稻耐旱資源和耐旱基因,解析耐旱機制,推進水稻耐旱性科學理論的發展,培育具有耐旱性的水稻品種具有重要的科學意義和應用價值[2]。本文就水稻耐旱性的基本定義、耐旱性鑒定方法和評價指標以及耐旱性分子遺傳研究進展進行綜述,以期進一步認識水稻耐旱性,為指導水稻耐旱性基礎研究和新品種選育提供理論參考。

1 耐旱性的基本定義

抗旱性是作物與干旱環境相互作用的復雜數量性狀。在自然界中,作物已經進行了一系列形態、生理和生化方面的進化來應對干旱脅迫?？购敌?Drought resistance,DR)是一個廣義的術語,主要包括逃旱性(Drought escape,DE)、避旱性(Drought avoidance,DA)、耐旱性(Drought tolerance,DT)和復原抗旱性(Drought recovery)[2]。從農業生產的角度而言,作物的抗旱性指干旱脅迫條件下相對于正常水分條件下的生物量或經濟產量,通常以兩種條件下的比值來表示,如相對鮮重或干重、相對產量或結實率等。目前廣受關注的是避旱性和耐旱性這兩種抗旱機制[2]。避旱性是作物在土壤含水量減少的情況下保持相對較高水勢的能力,主要依靠發達的根系從深層土壤中吸收水分或減少干旱脅迫下的蒸騰來實現。耐旱性指作物耐受低水勢并維持一定水平生理活動和生長發育的能力,主要通過增加細胞內滲透調節物質來維持細胞膨壓,并通過調節細胞防御酶的活性減少有害物質的積累。

2 水稻耐旱性的鑒定方法

2.1 干旱處理方法

干旱可能發生在水稻發育的各時期,較好的萌芽期和苗期耐旱性有利于進行旱直播并可提高成苗率,而分蘗期、孕穗期、開花期和灌漿期的耐旱程度則對產量有較大影響。其中,孕穗期對干旱最為敏感,苗期進行抗旱性鑒定較為方便,因此這兩個時期的植株耐旱性最為研究人員所關注。

聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)模擬干旱脅迫處理是研究萌芽期和苗期耐旱性常用的方法,通常在實驗室光照培養箱或人工氣候室進行。高分子量的聚乙二醇(PEG4000—8000)不易被植物吸收,可以改變營養液的滲透勢,引起植物水分虧缺[3]。通常在3葉期后,用15%—20%的聚乙二醇(PEG)溶液模擬干旱脅迫,也有利用育苗盤或托盤進行苗期土壤干旱脅迫或反復干旱脅迫[4]。

通常,在避雨棚內采用盆栽法于分糵期及以后的生長發育時期進行耐旱性鑒定。水稻根系的主要分布范圍在土層深度30 cm以內。在盆栽試驗中,水稻避旱特性難以發揮,呈現的是其耐旱性。筆者采用70 cm的深盆進行避旱性和耐旱性的鑒別試驗,土壤深度為60 cm,盆底側邊開洞并用橡膠塞堵塞洞口。干旱處理時拔除橡膠塞,一方面可加快排除土壤水分,另一方面也可避免盆底積水。在此試驗條件下,參試材料中深根比較小的水稻品種‘Blue Belle’能積累更多的脯氨酸,具有更高的過氧化物酶(POD)活性和超氧化物歧化酶(SOD)抑制率,表現典型的耐旱生理特性[5]。

盆栽試驗有一定的局限性,一是盆與盆之間干旱脅迫程度差異可能較大,尤其當植株個體生物量差異較大時;二是盆栽小環境與大田環境存在較大差異。因此,大田耐旱性鑒定非常有必要。在田間開展耐旱性研究需要阻斷深根吸水途徑,讓避旱性保持“中立”[6]。因此,一般在有犁底層的水田進行大田耐旱性鑒定,并配備防雨設施,如固定或活動的擋雨棚等。

“薄膜隔斷淺土層鑒定法”(圖1)[7]能更好地規避避旱性的影響,可在大田進行水稻耐旱性鑒定。此方法設計了一個專用的鑒定設施,包括一個棚頂及四周可以開閉的避雨大棚;將大棚內田塊開挖到30 cm深度并在該土層底部和四周鋪設隔離薄膜(0.15 mm,三層);再將土壤回填至土層深度為30 cm。利用該方法先后對水稻微核心種質和抗旱核心種質、重組自交系群體等進行了耐旱性鑒定,發現具有深根特性的旱稻品種‘IRAT109’的耐旱系數(旱田產量∕水田產量)僅為0.21,表明其耐旱性較差;而另外一個具有深根特性的品種‘IAC1246’的耐旱性系數為0.74,耐旱性較好。目前在上海市農業科學院青浦白鶴基地和上海市農業生物基因中心金山廊下基地均建有水稻耐旱性鑒定評價設施,可以滿足近千份水稻種質資源的耐旱性評價。

2.2 耐旱性指標

2.2.1 生理指標

水稻耐旱性相關的生理指標主要有滲透調節物質含量、抗氧化酶類活性和非酶類物質含量。

滲透調節是細胞水勢降低時,可溶性物質在細胞中積累以降低細胞滲透勢,維持細胞膨壓的過程。在干旱脅迫條件下,滲透調節受氣孔導度、光合作用、葉片含水量以及細胞生長影響。研究發現,干旱條件下水稻中游離氨基酸,特別是脯氨酸、可溶性糖等有機小分子溶質和無機離子大量積累[2]。

脯氨酸是最大的水溶性氨基酸,在植物響應干旱脅迫過程中起著非常重要的作用。提高脯氨酸含量可以降低葉水勢,提高植物對干旱和鹽脅迫的耐受性[8-9]。此外,脯氨酸還是細胞膜完整性的重要保護劑、干旱條件下重要的羥基自由基清除劑[10]。干旱條件下積累的可溶性糖主要有葡萄糖、果糖、蔗糖等。這些可溶性糖參與滲透調節,并在維持植物蛋白穩定方面起重要作用。此外,植物糖與逆境激素脫落酸(ABA)有關聯,參與調控植物非生物抗性[11]。晚期胚胎豐富蛋白(LEAs)是超親水蛋白,能在干旱脅迫環境中保護生物大分子,減輕水分脅迫對植物的傷害。細胞內的水孔蛋白主要分布在原生質膜和液泡膜上,具有促進和調節水分跨膜運輸的功能,可調控細胞膜上的水通道,選擇性的平衡水分進出細胞[12-13]。

在干旱脅迫過程中,植物體內會產生大量的活性氧物質,如超氧陰離子()、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)、單線態氧(1O2)等?；钚匝醯姆e累會對細胞成分造成氧化損傷,如破壞脂質和蛋白結構、DNA片段化、抑制酶活性、激活程序性細胞死亡途徑,導致細胞死亡等[14]。植物也進化出一套抗氧化保護系統來清除活性氧,維持細胞膜穩定性[14],這套活性氧清除保護系統主要由酶促清除系統和非酶促清除系統組成。酶促清除系統包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)等抗氧化酶類。干旱發生時,細胞內活性氧清除酶的活性及非酶類抗氧化物含量增加。在水稻中已知的耐旱基因OsPP18是依靠活性氧清除系統來提高耐旱性和抗氧化能力的典型例子[15];水稻DST基因也是通過調控過氧化氫(H2O2)含量影響氣孔開閉,實現對耐旱性和耐鹽性的調控[16]。非酶促清除系統包括抗壞血酸、谷胱甘肽等非酶類抗氧化物質。有研究表明,以抗壞血酸為種子引發劑可以提高小麥的抗旱性[17]。在擬南芥中增強EsWAX1基因的表達,可以提高表皮蠟質層和抗壞血酸含量,從而提高轉基因植株耐旱性[18]。在煙草和柱花草中共表達NCED和ALO兩個基因可以極顯著提高抗壞血酸的含量,進而增強植株對干旱和低溫的耐性[19]。筆者在水稻耐旱性的轉錄組學研究中發現,耐旱品種的差異基因被顯著富集在谷胱甘肽代謝、黃酮和類黃酮代謝、抗壞血酸代謝、類胡蘿卜素代謝等抗氧化相關代謝途徑,而敏感品種中差異基因則不能被顯著富集到這些抗氧化相關代謝途徑中[7]。

多胺是植物體內具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿,最常見的有腐胺、亞精胺和精胺,參與調節植物的生長發育和形態建成[20]。研究發現,水稻抗旱品種多胺的積累時間較早且持續時間較長[21]。亞精胺和精胺有穩定膜結構、保護DNA和蛋白質、清除超氧自由基的作用。水稻中的OsHSFA3基因通過調控多胺的合成提高耐旱性[22]。

2.2.2 發育和形態指標

芽期耐旱性鑒定指標主要包括發芽率和發芽勢。發芽率指測試種子發芽數占測試種子總數的百分比。發芽勢即種子從發芽開始到發芽高峰時段內發芽種子數占測試種子總數的百分比,可以反映測試種子的發芽速度和整齊度。

干旱脅迫下水稻的發育會受到不同程度抑制,出現葉片變小、株高降低、分糵減少、生育期延遲、生物量和產量減少等癥狀。苗期耐旱性鑒定的指標主要有根長、株高、生物量、存活率等。存活率一般于15—20 d的干旱脅迫后復水3—5 d時統計。分蘗期及生殖生長時期的耐旱性鑒定指標主要有葉面積、卷葉級別、葉片枯死率、分糵數、株高、生物量、生育期延遲天數等[23]。Zu等[24]對13個旱稻品種進行耐旱性鑒定,測量倒1、2、3葉的枯死部分長度和全葉長,利用兩者比值來判斷品種的耐旱性。葉片綠葉率也可以反映耐旱性,但要量化測定難度較大。本實驗室對55份水稻資源進行苗期PEG6000模擬干旱脅迫,分別從前視圖和俯視面進行RGB成像,利用機器視覺技術判讀圖片中的綠葉面積和枯死葉面積,發現前視圖和俯視面綠葉率與綠葉鮮重占比呈顯著正相關;利用圖像識別技術鑒定了200份重組自交系群體在PEG6000模擬干旱脅迫后的綠葉率,結合基因型數據開展了QTL定位分析,定位了多個耐旱QTL(未發表)。

2.2.3 產量

干旱,尤其是生殖生長階段的干旱影響穗發育、開花受精和灌漿成熟,造成產量減少,如穗長變短、一次枝梗和二次枝梗減少、穗粒數減少[23]。干旱可導致花粉育性降低進而降低結實率[25],而灌漿不飽滿會使千粒重下降,此外還會引起整精米率下降、堊白增加等,使稻米品質下降[26]。因此,干旱條件下的產量是評價耐旱性最重要的指標,也是育種實踐最終的評判和選擇標準。耐旱系數是指干旱處理產量與對照處理產量的比值,只反映品種對干旱的敏感程度,不代表品種在干旱脅迫下產量絕對值的高低[2]。耐旱指數是測試品種耐旱系數與對照品種耐旱系數的比值,對照品種一般選高產穩產且耐旱性較好的品種。

3 水稻耐旱性研究進展

3.1 稻種資源的耐旱性評價

耐旱資源的發掘與創新利用是水稻耐旱性研究的重要內容。自二十世紀七十年代以來,國內外科研人員開展了大量的水稻抗旱性鑒定評價。“七五”期間我國把水稻品種資源抗逆性鑒定列為國家重點科技項目。但長期以來水稻抗旱性的鑒定評價并沒有區分避旱性和耐旱性。

由于缺乏專用設施,耐旱性的資源鑒定評價主要局限在芽期和苗期。陸崗等[4]對廣西的464份栽培稻種質資源進行了苗期耐旱性鑒定,篩選出31份耐旱性強的種質資源。蔣荷等[28]利用育苗盤對1 777份國內外資源進行了苗期耐旱性鑒定,依據卷葉程度對參試資源進行了耐旱性分級,并對20份不同耐旱級別的資源進行了盆栽耐旱性鑒定。胡繼芳等[29]、Khan等[30]采用盆栽法對水稻種質資源進行耐旱性評價。王寶祥等[31]在深度為50 cm的水泥池中對91份國內外水稻品種進行了耐旱性鑒定,根據生物量和產量等相關性狀脅迫系數進行耐旱性評價,篩選出強耐旱品種17份,耐旱品種69份。本實驗室分別利用PEG脅迫處理和“薄膜隔斷淺土層鑒定法”進行了苗期和幼穗分化至抽穗期的耐旱性鑒定,對水稻微核心種質和抗旱核心種質開展了耐旱性鑒定,獲得了部分耐旱種質資源,如‘IAC1246’‘IR30358-084-1-1’‘TRESMESES’‘綠旱1號’‘QINGSIZHAN 1’等[23]。

3.2 水稻耐旱性的遺傳基礎研究

早期水稻耐旱性研究多集中在苗期耐旱QTL的定位,研究指標主要有細胞膜穩定性、相對生長速率、相對生物量、葉片持綠性等。Yue等[32]利用旱稻品種‘IRAT109’和水稻品系珍汕97B構建重組自交系群體,分別在黏土和砂土兩種條件下進行抗旱性QTL定位研究,未發現共定位QTL。在砂土干旱試驗中定位到5個抗旱系數相關的QTL,其中3個與根系QTL共定位。黏土干旱試驗在第2染色體的RM279—RM555區間定位到1個抗旱系數相關QTL和1個冠層溫度相關QTL,比對分析發現與該區間共定位的有1個滲透調節相關的QTL[33]。以上結果表明,避旱性和耐旱性具有不同的遺傳基礎。Tripathy等[34]利用104個DH系在抗旱大棚里開展耐旱性評價,不同株系的細胞膜穩定性存在顯著差異,變異呈現連續分布,推測其由微效多基因控制;利用315個分子標記開展連鎖分析,定位了9個與細胞膜穩定性相關QTL,分別位于第1、3、7、8、9、11和12號染色體,解釋的表型變異率在13.4%—42.1%。Kato等[3]利用‘Akihikari’與‘IRAT109’構建1個含有106個株系的BC1F6群體,采用聚乙二醇(PEG6000)模擬干旱脅迫,根據相對生長速率定位了3個耐旱性QTL,分別位于第2、4和7號染色體。本實驗室利用PEG6000模擬干旱脅迫,開展珍汕97B∕‘IRAT109’重組自交系群體(159個株系)的耐旱性評價,通過對水稻苗期株高、根長、苗高增長速率、苗高∕根長比值、卷葉級別等性狀進行分析,共檢測到24個相關的QTL,貢獻率在7.35%—39.30%;正常條件下檢測到13個相關的QTL位點,分布在第1、2、3、5、6、10、12號染色體上;干旱脅迫條件下檢測到11個相關的QTL位點,分布在第1、3、5、7、10、12號染色體上;其中,在1號染色體RM302—RM476B區間檢測到控制葉卷曲位點,正向效應來源于珍汕97B等位基因[35]。You等[36]使用相同的RIL群體在苗期進行ABA脅迫處理,在1號染色體RM237—RM302區間定位到葉卷曲相關位點(qLRC-1),其增效等位基因來源于珍汕97B。

華中農業大學熊立仲教授團隊利用高通量表型鑒定平臺可見光成像技術進行了水稻耐旱性全基因組關聯分析。利用盆栽試驗方法對507份水稻種質開展了耐旱性評價,鑒定了生物量相關性狀、葉片持綠性相關性狀、植株形態性狀等,通過全基因組關聯分析定位了470個顯著關聯位點,其中有437個位點與前人報道的抗旱QTL區間位置一致,313個關聯位點可以在兩年的試驗中重復定位到,過量表達OsPP15基因使植株對干旱更加敏感[37]。

3.3 水稻耐旱性功能基因研究

水稻作為最早完成全基因組測序的模式作物,其分子生物學和功能基因組學研究已取得較大發展。利用突變體篩選、基因表達芯片、比較轉錄組等方法發掘了大量的耐旱相關候選基因,相當一部分基因的耐旱性功能也通過轉基因得到證實(表1)。這些基因主要可分為三大類:(1)信號轉導基因,包括Ca2+結合蛋白(CaM、CDPK等)、細胞周期蛋白激酶(MAPK、MAPKKK)等編碼基因[38-39];(2)轉錄因子基因,如AP2∕EREBP、bZIP、MYB∕MYC、WRKY、Zinc finger、NAC、GT編碼基因[40-41];(3)具有保護或其他調節轉運功能的蛋白基因,如E3泛素連接酶、海藻糖合成酶等編碼基因[42-43](表1)。

表1 部分已被克隆耐旱基因Table 1 Partial cloned drought tolerant genes

干旱脅迫下的信號轉導是干旱響應分子調控機制的重要環節。水稻中的DSM1基因屬于MAPKKK家族,其突變體在幼苗期和幼穗分化期對干旱的敏感性強于野生型,過量表達DSM1基因使水稻幼苗的抗失水能力顯著增強[38]。水稻鈣依賴型蛋白激酶OsCPK9受ABA、PEG6000和鹽脅迫等誘導表達,該基因可以改善干旱脅迫條件下的滲透調節能力并關閉氣孔,正向調控水稻耐旱性和結實率[42]。另外,過量表達鈣依賴型蛋白激酶OsCDPK7可以提高水稻對干旱等逆境條件的耐受性[72]。

過表達AP2∕ERF轉錄因子SUB1A可提高水稻耐旱性和耐淹能力[40]。過表達乙烯響應元件結合蛋白基因OsEREBP1會激活脫落酸和茉莉酸合成通路相關基因以及防衛反應信號,提高轉基因水稻的耐淹性和耐旱性,同時增強抗白葉枯病的能力[47]。過量表達OsERF71可促進ABI5和PP2C68基因上調表達,提高水稻在干旱條件下的產量[73]。多個NAC家族轉錄因子如SNAC1、SNAC3、OsNAC5、OsNAC6、OsNAC14和ONAC22等正向調控水稻耐旱性。bZIP家族轉錄因子OsbZIP23、OsbZIP33、OsbZIP40、OsbZIP42、OsbZIP45、OsbZIP62、OsbZIP66、OsbZIP71等也已被證實可正調控水稻的耐旱性。OsMYB48-1受干旱、脫水、H2O2、鹽、低溫等非生物逆境誘導表達,過量表達OsMYB48-1可以提高植株耐旱性(存活率),表現為脯氨酸含量升高,丙二醛含量下降。鋅指類轉錄因子DST與活性氧相關基因啟動子中的DBS元件直接結合,通過影響活性氧的積累和氣孔開閉,實現對植株耐旱性和耐鹽性的調控。而且DST基因還通過調控Gn1a∕OsCKX2的表達提高水稻產量[74]。過量表達WRKY家族中OsWRKY11可以提高轉基因水稻苗期耐旱性和對白葉枯病的抗性[64]。

本實驗室結合抗旱QTL定位和表達譜數據,從抗旱QTL區間內克隆了正向調控水稻耐旱性基因OsGRAS23和OsAHL1,其過量表達可以提高苗期干旱脅迫存活率和生殖生長期干旱脅迫下的產量[70-71]。OsbZIP62是耐旱水稻品種干旱脅迫下轉錄調控網絡的節點基因,過量表達該基因可以提高水稻苗期干旱脅迫下的存活率[56]。

3.4 水稻耐旱性的多組學研究

在過去的20年里,轉錄組、蛋白質組和代謝組等組學技術被廣泛應用于水稻耐旱研究中,極大地推進了對逆境下植物響應基因和調控網絡的識別[75-76]。通過比較耐旱品種和敏感品種干旱處理前后組學成分的含量變化,發掘重要的基因、蛋白質或代謝物。在轉錄組研究中,耐旱與敏感品種的差異基因集中在信號轉導、轉錄調控、細胞壁修飾相關途徑,以及滲透調節、活性氧清除及能量代謝相關的途徑[7]。本實驗室利用3個耐旱品種(‘IAC1246’‘矮密’‘TRESMESES’)和3個耐旱性較差的品種(‘CICA4’‘IRAT109’‘IPECA0162’)鑒定了344個響應干旱脅迫的microRNA,進一步分析發現其中21個microRNA同時與耐旱性和產量存在正向相關作用,推測其具有較大的育種價值[77]。另外,在耐旱品種‘IAC1246’和耐旱性較差的品種‘IRAT109’中進行應答干旱脅迫的轉錄組學和代謝組學分析,分別鑒定到2 677個和4 059個耐旱基因以及47個和69個差異代謝物,‘IAC1246’表現出更好的抗氧化能力和光合作用能力,其差異基因可以被顯著富集到抗氧化相關代謝途徑(如類黃酮代謝途徑、抗壞血酸代謝途徑、谷胱甘肽代謝途徑等)和光合代謝相關途徑。在應答干旱脅迫過程中很多與光合作用有關的基因在‘IAC1246’中上調表達,光合保護劑阿魏酸含量急劇上升[7]。

此外,近年來研究人員逐漸將組學技術與GWAS技術聯合以用于耐旱基因的發掘,如利用轉錄組獲得e-QTL[78]、利用代謝組獲得meta-QTL[79]、利用光譜等表型組技術獲取i-QTL[37]。本實驗室目前在利用多光譜技術對重組自交系群體進行耐旱性鑒定。

4 結語與思考

水稻的抗旱育種要兼顧避旱性和耐旱性。提高避旱性可以提高水稻對水分的吸收能力并減少植株水分散失;而增強耐旱性可以提高水稻對缺水的耐受能力,維持其正常的生理代謝功能[80-82]。

耐旱性和避旱性各自具有明顯的形態學與生理生化特性及不同的遺傳基礎和調控機制[32]?？茖W區分不同的抗旱機制并根據其特性開展鑒定評價是水稻抗旱研究的基本立足點。自然條件下,當干旱發生時,各抗旱機制因植株個體的發育時期、干旱的嚴重程度及發展進程等,可能先后或同時在植株的不同或相同的組織部位發揮作用,植株個體最終的抗旱表現是各種機制共同作用的結果。

在耐旱性遺傳分析中,要考慮兩個因素:一是耐旱鑒定應盡可能在大田環境中進行,盡量規避避旱性的干擾;二是需具備一定規模的群體和高密度的基因型數據,使耐旱性QTL的定位可以精準到單基因水平。雖然已在水稻中克隆了大量的耐旱基因,但耐旱性的標記輔助選擇育種進展緩慢?？赡苡袔讉€方面的原因:一是有相當一部分基因僅在苗期進行功能驗證,未在生殖生長期進行耐旱性評價;二是基因效應較小,植株耐旱性提升不明顯;三是基因可能對植株生長發育、產量或品質存在負效應[82]。綜上,需要進一步發掘具有育種價值的耐旱基因。

總的來說,水稻的耐旱性在鑒定方法、資源評價、遺傳基礎和功能基因研究等方面都積累了大量成果,但從實現全基因組選擇設計育種以及智能育種的目標來看,還有大量的工作有待開展。(1)水稻耐旱性是由微效多基因調控的,調控網絡和調控機制仍然需要深入研究。(2)新的技術可以進一步應用于耐旱性研究中。例如,單細胞測序可用于了解組織中各細胞內及細胞間的基因表達與調控,判別各類細胞參與的生理生化反應?；蚪M、表型組等多組學高效檢測技術可以促進耐旱性遺傳基礎的解析,加快基因發掘的效率。(3)各組學的聯合應用,包括一些特殊的組學分析,如甲基化組、脂質蛋白組,磷酸化修飾蛋白組等,為耐旱性狀的遺傳模型構建及人工智能設計育種提供了更多的數據支撐。(4)CRISPR∕Cas9技術能夠精確地編輯基因,可以根據需要快速創制新等位基因或者替換為有利等位基因。隨著越來越多的耐旱基因被發掘,可能在不久的將來就能實現水稻耐旱性分子設計育種[83]。