食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM能力驗證結果分析與討論

周 露

（寶應縣產品質量綜合檢驗檢測中心，江蘇揚州 225800）

微生物污染引起的食源性疾病是世界各國普遍關注的問題。大腸埃希氏菌O157:H7/NM是一種通過肉類或乳類食品傳播的致病性大腸桿菌，這類病菌不僅能引起食物中毒，還能引起腸道內出血，因此又被稱為“出血性大腸桿菌”。對食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM的檢測和監控是預防與控制食源性疾病的重要技術手段。本實驗室參加了大連中食國實檢測技術有限公司組織的大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢測能力驗證活動。

目前，能力驗證已成為中國合格評定國家認可委員會保障實驗室認可有效性極為重要的手段[1]。對于實驗室而言，能力驗證是非常有效的外部質量控制方式，利用能力驗證結果能有效提升檢驗人員的檢測能力及實驗室檢測水平。完成能力驗證的過程能核驗儀器設備的準確性、穩定性，驗證檢驗人員的技術能力，能力驗證結果可證明實驗室已具備一定的技術能力。同時，每參加一個能力驗證項目，都能提升實驗室檢驗人員的技術水平，為以后的實驗室現場評審和各項檢查提供有力的證據。因此，實驗室應加強開展能力驗證活動，結合檢驗工作自身需求和能力驗證領域及頻次要求，積極尋求并主動參加能力驗證和實驗室間比對，覆蓋能力范圍內的專業領域，以滿足CNAS能力驗證規則的 要求。

1 材料與方法

1.1 檢驗依據

《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》（GB 4789.36—2016）[2]和大連中食國實檢測技術有限公司《食品中大腸埃希氏菌O157:H7的測定能力驗證計劃作業指導書》（CFAPA—1190）。

1.2 材料與設備

1.2.1 儀器

電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（日本株式會社平山制作所）；電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；法國AES均質器（法國AES儀器有限公司）；超純水機（Thermo Fisher SCIENTIFIC 公司）；數顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）；顯微鏡（德國LEICA）；酸度計（北京賽多利斯儀器有限公司）；暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；藥品保存箱（青島Haier）；二級生物安全柜B2（新加坡ESCO）。

1.2.2 試劑

改良EC肉湯（mEC＋n）；改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）；三糖鐵瓊脂（TSI）；營養瓊脂；半固體瓊脂；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG（MUG-LST）；氧化酶試劑；革蘭氏染色液；大腸埃希氏菌O157:H7/NM生化鑒定試劑盒。

1.2.3 菌種

大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、大腸埃希氏菌O157/H7（NCTC 12900），均購自廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心。

1.2.4 樣品

大腸埃希氏菌O157:H7能力驗證樣品是添加特定菌株的乳粉冷凍干燥樣品，共3瓶，瓶號分別為349、143和142。樣品由大連中食國實檢測技術有限公司提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 增菌

根據組織方作業指導書要求，樣品前處理按照作業指導書進行，從冰箱中取出樣品后，待樣品達到室溫時方可開啟使用。西林瓶中處于高真空狀態，開啟時應按照要求。樣品中含有活微生物，不可直接用手接觸西林瓶內樣品，從開啟樣品到測試結束均按照無菌操作進行，在生物安全柜內將大腸埃希氏菌O157:H7樣品的西林瓶打開，立即加入少量（2～4 mL）生理鹽水稀釋液進行再水化，稀釋液合計40 mL，待溶解后，吸出放入無菌三角瓶中，反復用剩余的生理鹽水稀釋液清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入上述的無菌三角瓶中，此溶液即是待測樣品原液（該40 mL液體即為待測原液，即100），全過程在20 min內完成。取25 mL待測液加入含有225 mL mEC＋n肉湯的均質袋中，在拍擊式均質器上連續均質1 min，充分勻質混勻。依此方法，分別對3件樣品進行處理。同時按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》（GB 4789.36—2016）作陽性對照實驗。上述增菌液在36 ℃環境下培養24 h。

1.3.2 分離

取增菌后的mEC＋n肉湯，劃線接種于CTSMAC平板和大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上， 36 ℃培養24 h，觀察菌落形態。在CT-SMAC平板上，典型菌落為圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現較暗的灰褐色；在大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上呈現紫紅色菌落。結果顯示，349、142在CTSMAC平板及大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上均無可疑菌落，143及標準菌株均有典型菌落生長。

1.3.3 初步生化試驗

從CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157:H7顯色瓊脂平板上分別挑取5～10個可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時接種MUG-LST肉湯，并用大腸埃希氏菌（ATCC 25922）作陽性對照和大腸埃希氏菌O157/H7（NCTC 12900）作陰性對照，于36 ℃培養24 h。同時進行氧化酶和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈黃色，產氣，不產硫化氫。置MUG-LST肉湯管于暗箱式紫外分析儀下觀察，MUG陽性的大腸埃希氏菌有熒光產生，MUG陰性的無熒光產生，大腸埃希氏菌O157:H7/NM為MUG試驗陰性，無熒光。

1.3.4 鑒定

挑取可疑菌落，在營養瓊脂平板上分純，于 36 ℃培養24 h，并進行鑒定。①血清學試驗。在營養瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157和H7診斷血清作玻片凝集試驗。②生化試驗。自營養瓊脂平板上挑取菌落，進行生化試驗。

2 結果與分析

2.1 初步生化試驗

TSI、MUG-LST、氧化酶和革蘭氏染色結果見表1。

表1 TSI、MUG-LST、氧化酶和革蘭氏染色結果

2.2 血清學和生化試驗鑒定結果與分析

①血清學試驗。在營養瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157和H7診斷血清作玻片凝集試驗。143號及標準菌株在O157:H7血清上均凝集。②生化試驗。自營養瓊脂平板上挑取菌落，進行生化試驗，結果見表2。綜合生化和血清學試驗結果，得知編號143的樣品檢出大腸埃希氏菌O157:H7，其余2個樣品均未檢出大腸埃希氏菌O157:H7。

表2 營養瓊脂平板上可疑菌落生化結果

3 結論與討論

本次能力驗證在規定時間內提交結果，結果為滿意。通過此次試驗總結出以下經驗。①能力驗證工作較為復雜，對檢測人員的操作水平和檢測經驗要求極高[3]。因此，要提前熟悉檢測標準，準備好儀器設備，購買相關試劑，確保滿足檢測需求。②在試驗過程中應注意，收到樣品后立即按要求于 -18 ℃冷凍保存，準備開展檢測時，把樣品從冰箱取出后，待樣品達到室溫方可開啟使用，以防止出現假陰性。③確保能力驗證的培養基試劑、菌株的質量[4]。對培養基試劑、菌株按要求進行全面的性能測試，避免因培養基試劑質量問題導致結果偏差。④定性樣品中含有一些與目標菌生化特征相似的背景菌，檢測中在挑取可疑菌落時應按標準要求挑取足夠的可疑菌，避免沒有選中正確的陽性菌落，造成假陰性結果。⑤進行生化試驗時，對照生化鑒定試劑盒的說明書嚴格操作，注意賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶應用石蠟封層培養。不同的生化試驗管培養溫度及時間有差異，培養過后還要進一步滴加試劑，及時觀察結果并記錄。⑥檢測結束后，對所有使用過的玻璃器皿、增菌液、平板和生化試驗管等及時進行無害化處理，避免交叉污染[5]。

綜上所述，通過能力驗證可充分了解檢測過程中存在的不足，因此實驗室應積極參加外部質量控制活動，注重能力驗證活動的開展，逐步提升實驗室的技術水平，增強樣品檢測過程中的質量意識。