葛根提取物薄層鑒別與含量測定

陳炎歡，馮華業，黃照榮，江志鵬，黃綺敏

（無限極（中國）有限公司，廣東江門 529100）

葛根提取物是由豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]的干燥根提取制得，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經活絡及解酒毒等作用，是藥食兩用的天然植物資源。葛根提取物作為市場暢銷的中藥提取物之一，制定其質量標準對其在中藥產業的發展有非常重要的意義[1-5]。本文主要對葛根提取物中的葛根素進行薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）和高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）鑒別和含量測定，為制定葛根提取物的質量標準提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

葛根提取物，由無限極（中國）有限公司提供；葛根素對照品，批號：201816，購自中國食品藥品檢定研究院；高效硅膠G薄層板，分別購自德國Merck和青島海洋化工有限公司；甲醇、三氯甲烷，分析純，購自廣州化學試劑廠。

1.2 儀器

ThermoFisher UltiMate 3000高效液相色譜儀，帶二極管陣列檢測器（Diode Array Detector，DAD）；瑞士Mettler XPR2型百萬分之一電子天平；Fisherbrand FB11209型超聲波清洗儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 薄層色譜鑒別

（1）對照品溶液配制。取葛根對照藥材0.8 g，置于錐形瓶中，加入甲醇6 mL，超聲（250 W，40 Hz）處理30 min，濾過，取續濾液，即得對照藥材溶液。

（2）供試品溶液配制。取本品粉末約0.1 g，置于錐形瓶中，加入甲醇10 mL，超聲（250 W，40 Hz）處理30 min，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取葛根素對照品適量，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為供試品溶液。

（3）薄層色譜測定。按照薄層色譜法（中國藥典2020年版通則0502）試驗，吸取上述3種溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7.00∶2.50∶0.25）為展開劑，取出晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

1.3.2 含量測定

（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（150 mm或250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（25∶75，體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；波長：250 nm；進樣量：10 μL；理論塔板數按葛根素計不低于4000。葛根素與其他組分能得到很好的分離，且出峰時間適宜，峰形良好。

（2）對照品溶液制備。精密稱取葛根素對照品12.5 mg于100 mL容量瓶，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到125 μg/mL葛根素對照品儲備液。

（3）供試品溶液制備。精確稱取粉碎均勻的葛根提取物樣品約0.1 g，置100 mL容量瓶中，加入30%乙醇約80 mL，超聲（250 W，40 Hz）處理30 min，取出，冷卻后定容至刻度，搖勻。取上清液1 mL至5 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，即為稀釋5倍的測試液。取適量樣液過0.45 μm的微孔濾膜，取續濾液后供液相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 薄層色譜鑒別

取葛根對照藥材、葛根素、葛根提取物進行測試。由圖1可知，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，Rf值在0.3～0.7，符合薄層鑒別要求。

圖1 對照品及葛根提取物薄層圖

2.2 線性關系考察

精密稱取葛根素對照品13.10 mg于100 mL容量瓶，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到124.97 μg/mL葛根素對照品儲備液。精密吸取葛根素對照品儲備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、 4.0 mL及5.0 mL分別置10 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，在規定色譜條件下進行色譜分析，測定峰面積。以葛根素對照品濃度（μg/mL）為橫坐標，平均峰面積為縱坐標，制作標準曲線（圖2），求出線性回歸程為Y=0.7675X+0.0498，R2=0.9996。結果表明葛根素在6.25～62.49 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系。

圖2 葛根素標準曲線

2.3 精密度試驗

精密吸取葛根素對照品溶液（濃度37.49 μg/mL）10 μL進樣，重復進樣6次，分別計算峰面積及保留時間的RSD值，保留時間和峰面積的RSD值分別為0.57%和0.28%。理論塔板數以葛根素計約6000，表明儀器精密度良好，結果見表1。

表1 精密度試驗結果（n=6）

2.4 穩定性試驗

取葛根提取物按上述色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h及24 h測定，結果見表2，供試品中葛根素峰面積的RSD為0.22%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

表2 穩定性試驗結果（n=6）

2.5 重復性試驗

取葛根提取物同一天內按上述色譜條件測定，結果見表3。葛根素平均含量為15.67%，RSD為0.56%，分離度大于1.5。表明該方法重復性良好。

表3 重復性試驗結果

2.6 回收率試驗

取葛根提取物（葛根素含量為15.67%）精密稱定約0.05 g于9個100 mL小燒杯中。另取葛根素對照 品（純 度95.4%）165.493 mg置100 mL容 量 瓶中，加30%乙醇溶解并定容（此對照品溶液含葛根素 1.5788 g/mL），分別吸取該對照品溶液2.5 mL（以葛根素計3.9470 mg）、5.0 mL（以葛根素計7.8940 mg）、 7.5 mL（以葛根素計11.8410 mg），分3組加入含樣品的9個100 mL容量瓶中，按色譜條件測定，計算葛根素的回收率，回收率數據分別為99.39%、103.90%、101.79%、102.56%、103.99%、103.83%、102.12%、104.63%及102.84%，平 均 回 收 率 為102.78%（95%～105%），RSD值為1.55%，表明該方法準確度良好。

2.7 樣品含量測定

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶各10 μL，注入液相色譜儀，測定。根據所得對照品溶液和供試品溶液色譜圖中葛根素峰面積計算供試品中待測組分葛根素含量，結果見表4。

表4 樣品的含量測定結果（n=3）

3 結論與討論

葛根提取物經過提取后，與葛根藥材在基質上存在差別，本研究中的鑒別方法，與中國藥典中葛根藥材的供試品溶液制備方法略有不同，試驗結果表明，本研究方法滿足薄層鑒別的要求，可用于葛根提取物的鑒別。本研究方法穩定性、精密度、重復性以及準確度均符合方法學的要求，可用于葛根提取物葛根素含量的檢測