高效液相色譜法測定茶飲料中的咖啡因含量

寧 煒

（山西省檢驗檢測中心(山西省標準計量技術研究院)，山西太原 030012）

咖啡因，又稱咖啡堿，是一種從咖啡或茶葉中提取的黃嘌呤生物堿化合物，具有使人體中樞神經系統興奮的作用，適度使用可以祛除疲勞、振奮精神，然而長期或超劑量攝入會對人體肝腎功能造成損害，而且其具有成癮性，停用后會出現身體疲乏、精神不振等癥狀[1-4]。近年來，含咖啡因成分的咖啡、茶飲料、功能性飲料等十分暢銷，市場調研發現，許多茶飲料都使用了咖啡因食品添加劑，且茶葉的加入也有原料帶入的可能，因此茶飲料中咖啡因的檢測十分必要[5-7]?！恫栾嬃稀罚℅B/T 21733—2008）[8]中對各類茶飲料中的咖啡因含量均有相關規定?！妒称钒踩珖覙藴?飲料中咖啡因的測定》 （GB 5009.139—2014）[9]中規定了高效液相色譜法測定可樂型飲料、咖啡、茶飲料中咖啡因的檢測方法，推薦使用紫外檢測器（Ultraviolet Absorption Detector，UVD）或二極管陣列檢測器（Diode Array Detector，DAD），其中DAD檢測器能夠進行全波長光譜掃描，更有助于準確定性，減少假陽性誤判?；诖?，本研究參照GB 5009.139—2014，建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定茶飲料中咖啡因含量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌茶飲料購自某超市；咖啡因標準品（純度99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，美國飛世爾試劑公司）；氧化鎂（分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司）；實驗室用水為一級超純水。

1.2 儀器與設備

LC-2030C 高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器，日本島津公司）；MS105DU電子天平（精度0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司）；XS204電子天平（精度 0.1 mg，瑞士梅特勒托利多公司）；KQ5200DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；0.45 μm微孔水相濾膜（天津津騰實驗設備有限公司）；Synergy超純水機（德國密理博公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

（1）標準儲備液配制。精密稱取19.65 mg咖啡因標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋、定容至刻度，配制成質量濃度為1963.04 μg/mL的咖啡因標準儲備液。

（2）標準中間液配制。準確吸取1.0 mL咖啡因標準儲備液于10 mL容量瓶中，用超純水稀釋、定容至刻度，配制成質量濃度為196.30 μg/mL的咖啡因標準中間液。

（3）標準工作液配制。準確吸取0.3 mL咖啡因標準儲備液于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配成濃度為58.89 μg/mL的標準溶液；分別吸取 0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL和1.0 mL咖啡因標準工作液于10 mL容量瓶中，用超純水定容得標準系列濃度分別為1.96 μg/mL、4.91 μg/mL、9.82 μg/mL和19.63 μg/mL；分別吸取0.03 mL、0.10 mL、0.20 mL及0.50 mL濃度為19.63 μg/mL的標準溶液于10 mL容量瓶中，用超純水定容得標準系列溶液濃度分別 為0.059 μg/mL、0.200 μg/mL、0.390 μg/mL及 0.980 μg/mL。

1.3.2 試樣處理過程

精密稱取5 g樣品于10 mL比色管中，加入超純水定容至5 mL，搖勻，加入0.5 g氧化鎂，振搖，靜置，取上清液經微孔濾膜過濾，上機檢測。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：艾杰爾Promosil C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇+水（24+76），等度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；DAD檢測器波長：272 nm；進樣量：10 μL。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

分別將配制的質量濃度為0.059 μg/mL、 0.200 μg/mL、0.390 μg/mL、0.980 μg/mL及1.960 μg/mL 的標準系列溶液與質量濃度為4.91 μg/mL、 9.82 μg/mL、19.63 μg/mL、58.89 μg/mL及196.30 μg/mL 的標準系列溶液按照1.4液相色譜條件上機測試，以咖啡因的質量濃度（x）為橫坐標，以其對應測得的色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制標準工作曲線，計算曲線方程和線性系數。由表1可知，咖啡因在0.059～1.960 μg/mL與4.91～196.30 μg/mL均表現出良好的線性關系，相關系數均大于0.999。

表1 咖啡因的線性范圍、曲線方程和線性系數

2.2 加標回收率與重復性

準確稱取9份陰性茶飲料，結合方法的線性范圍向1～3號試樣中添加0.5 mL濃度為1.96 μg/mL的咖啡因標準溶液，4～6號試樣中添加0.15 mL濃度為1963.04 μg/mL的咖啡因標準溶液，7～9號試樣中添加0.30 mL濃度為1963.04 μg/mL的咖啡因標準溶液，按照1.3.2試樣處理過程操作，1.4液相色譜條件測試，計算方法的加標回收率。由表2可知，茶飲料中咖啡因在0.196～117.782 mg/kg添加水平下，回收率為96.43%～103.31%。向陰性茶飲料中添加 0.15 mL濃度為1963.04 μg/mL的咖啡因標準溶液，平行測定6次，考察方法的重復性（用相對標準偏差RSD表示），方法的重復性RSD為1.56%，具體見表3。由此可見，方法的加標回收率與重復性均滿足GB/T 27404—2008[10]中的規定，測定結果準確可靠。

表2 咖啡因的加標回收試驗結果統計（n=3）

表3 咖啡因的重復性驗證結果統計（n=6）

2.3 檢出限與定量限

精密稱取5 g陰性茶飲料，加入0.15 mL濃度為1.96 μg/mL的咖啡因標準溶液，按照1.3.2試樣處理過程操作，1.4液相色譜條件測試，測得色譜峰響應值大于3倍噪音，計算得出方法的檢出限為 0.059 mg/kg。根據加標回收率試驗中低濃度回收率結果可知中該方法中咖啡因定量限為0.2 mg/kg。

3 結論

本研究參照GB 5009.139—2014，建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定茶飲料中咖啡因含量的分析方法。該方法前處理過程簡便，Promosil C18色譜柱分離效果好，分析速度快，使用二極管陣列檢測器可以進行準確定性定量，經過方法學驗證，該方法線性關系良好，加標回收率和精密度、檢出限與定量限等均符合相關標準要求，可以滿足檢驗檢測機構對茶飲料中咖啡因的批量快速檢測。