基于PI3K-Akt-eNOS通路探討瘀毒清丸對鐵過載導致的心肌損傷小鼠的保護作用*

楊志文 葉 星 古學奎

（1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405）

機體內的鐵主要是通過影響氧化應激而影響機體的健康［1］。當機體內鐵過多時，被稱為“鐵負荷過載”（iron overload），簡稱鐵過載［1］。過多的鐵在機體實質細胞進行性沉積，逐漸引起組織器官損傷，產生心功能不全等癥狀［2］。有研究表明［3］，鐵過載患者存在明顯的心肌損傷和心臟功能障礙。

瘀毒清丸是廣州中醫藥大學第一附屬醫院的院內制劑，近年來用于治療鐵過載造成的心肌損傷患者取得了較好的臨床療效，但其作用機制尚未明確。針對鐵過載造成的心肌損傷，現代醫學主要使用地拉羅司（DFX）作為2歲以上患者的一線除鐵藥物［4］。本研究將其作為陽性對照來驗證瘀毒清丸治療鐵過載心肌損傷的療效。而有研究表明，通過促進磷脂酰肌3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路的下游產物內皮型一氧化氮合酶（eNOS）的合成能對心肌細胞起到保護作用［5］，且可能與抗氧化應激反應有關［6］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6J小鼠70只（由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供），2月齡，純系雄性，體質量15～20 g，動物生產許可證號：SCXK（粵）2018-0034。課題設計符合《廣州中醫藥大學動物實驗倫理審查條例》要求，倫理號：20201221001。

1.2 實驗藥物 瘀毒清丸，主要成分為大黃、川芎、生地黃、半枝蓮、黃芩，廣州中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，粵藥制字Z20071202。使用前將瘀毒清丸研磨成粉，再用蒸餾水稀釋成1 mg/mL的溶液，存于-80℃的冰箱。地拉羅司分散片（恩瑞格，瑞士諾華，國藥準字H20150208，規格：125 mg×28片，貨號B802695）。

1.3 試劑與儀器 異氟烷［華中海威（北京）基因科技有限公司，編號O21402，貨號KGY001］；血清肌鈣蛋T（cTnT）、血清肌鈣蛋I（cTnI）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、一氧化氮（NO）、eNOS、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）ELISA檢測試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司批號分別為23738901、23340241、23266450、23250126、23849002、23451352、23355361、23361237；貨號分別為430639、430644、430653、430438、430848、440670、440652、440656）；LY294002（Sigma公司，批號 028K5716，貨號為382052）；兔抗小鼠Akt，p-Akt，eNOS，p-eNOS 多克隆抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（二抗）（Cell Signaling公司，批號分別為#4821，#4060，#32027，#9570，#14708，貨號為YB-012、YB-023、YB-044、YB-067、YB-019）FC酶標儀（賽默飛世爾公司）；BS-220型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子有限公司）；CX33三目生物顯微鏡（上海奧林巴斯）；Allegra X-15R型醫用離心機（美國Beckman Coulter公司）、AX-Ⅱ型凝膠成像儀（美國Life Technology公司）、FX-7542型心電圖機（日本福田）。

1.4 分組與造模 將70只C57BL/6J小鼠隨機分為7組：空白對照組，模型組（右旋糖酐鐵），瘀毒清丸低、中、高劑量組，地拉羅司組（陽性對照），瘀毒清丸+PI3K抑制劑（LY294002）組，每組10只。空白對照組予以腹腔注射200 μL的生理鹽水；其他組小鼠予以腹腔注射1 mg/kg右旋糖酐鐵建立鐵過載小鼠模型（以小鼠血清鐵濃度判斷造模是否成功）［7］，3 d 1次，每次200 μL，共2周。

1.5 給藥方法 根據實驗動物與人用藥量的換算，瘀毒清丸組小鼠以瘀毒清丸成年人（體質量按70 kg計算）常規用藥劑量［27 g/d，即0.386 g（/kg·d）］，換算成小鼠劑量為低劑量3.51 g（/kg·d）、中劑量7.02 g（/kg·d）、高劑量14.04 g（/kg·d），灌胃量0.5 mL/20g。地拉羅司成人起始劑量為20 mg（/kg·d），換算成小鼠劑量為182 mg（/kg·d），灌胃量0.5 mL/20 g。瘀毒清丸+LY294002組先經尾靜脈注射LY294002 mg/kg，再按照瘀毒清丸組中劑量灌胃給藥。空白對照組和模型組每日清晨予生理鹽水0.5 mL/20 g，每日3次。連續給藥12周。

1.6 標本采集與檢測 1）血清cTnT、cTnI、CK、LDH、NO、eNOS、SOD、MDA的含量：于末次給藥后24 h摘除小鼠眼球，在眼眶處取血2 mL左右，靜置1 h后，以1 500 r/min離心20 min，取血清，采用ELISA法檢測cTnT、cTnI、CK、LDH、NO、eNOS、SOD、MDA 的含量。嚴格按照各試劑盒說明書操作。2）心肌組織P-Akt、P-eNOS、Akt、eNOS蛋白含量：將小鼠心肌組織剪碎，加入裂解液使其充分裂解。以10 000 r/min離心10 min，取上清液，提取總蛋白，定量變性后進行SDS-PAGE電泳，隨后轉移到PVDF膜上。封閉2 h（5%的脫脂牛奶），P-Akt、P-eNOS、Akt、eNOS抗體按說明書稀釋，孵育（4℃）過夜。用1×TBST充分清洗后，HRP標記的二抗室溫孵育2 h。用1×TBST清洗后進行顯影，用ImageJ軟件分析目標蛋白灰度值。

1.7 統計學處理 應用SPSS25.0軟件分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組血清肌鈣蛋白cTnT與cTnI及血清鐵濃度的比較 見表1。在血清肌鈣蛋白cTnT、cTnI、血清鐵濃度方面，與空白對照組比較，模型組水平明顯升高（P＜0.01），表明造成鐵過載的模型成功。與模型組比較，地拉羅司組以及瘀毒清丸低、中、高劑量組水平明顯下降（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組相比，瘀毒清丸+LY294002組在血清肌鈣蛋白cTnT、cTnI、血清鐵濃度方面，差異無統計學意義（P＞0.05），說明LY294002抑制了瘀毒清丸對心肌的保護作用。與地拉羅司組比較，瘀毒清丸低、中劑量組血清肌鈣蛋白cTnT、cTnI、血清鐵濃度方面，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），瘀毒清丸高劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。瘀毒清丸高劑量組在上述指標方面均優于低劑量組（P＜0.01或P＜0.05）；中劑量和低劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組血清肌鈣蛋白cTnT、cTnI及血清鐵濃度比較（±s）

表1 各組血清肌鈣蛋白cTnT、cTnI及血清鐵濃度比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與地拉羅司組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與瘀毒清丸低劑量組比較，++P＜0.01。下同。

組別空白對照組模型組地拉羅司組瘀毒清丸低劑量組瘀毒清丸中劑量組瘀毒清丸高劑量組瘀毒清丸+LY294002組n 10 10 10 10 10 10 10 cTnT（pg/mL）57.68±8.39 187.48±25.47**81.52±6.65##112.11±30.28##△△107.24±20.60##△92.14±2.25##++197.48±44.09 cTnI（μg/L）0.31±0.09 2.37±0.14**0.46±0.03##2.18±0.23#△△1.99±0.37#△△0.53±0.06##++2.25±0.12血清鐵濃度（μg/mL）5.81±0.87 13.56±2.13**7.76±1.31##10.37±1.53#△△9.48±1.24#△△8.32±1.16##++13.21±0.98

2.2 各組血清CK、LDH、NO、eNOS水平的比較 見表2。在血清CK、LDH方面，與空白對照組比較，模型組水平明顯上升（P＜0.01）；與模型組比較，地拉羅司組以及瘀毒清丸低、中、高劑量組水平明顯下降（P＜0.01或P＜0.05）。在血清NO、eNOS方面，與空白對照組比較，模型組水平明顯下調（P＜0.01）；與模型組比較，地拉羅司組以及瘀毒清丸各個劑量組水平明顯上升（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組相比，瘀毒清丸+LY294002組在血清CK、LDH、NO、eNOS方面，差異無統計學意義（P＞0.05），說明LY294002抑制了瘀毒清丸對心肌損傷的保護以及舒張血管的作用。與地拉羅司組比較，瘀毒清丸低、中劑量組血清CK、LDH、NO、eNOS方面，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），瘀毒清丸高劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。瘀毒清丸3個劑量組比較，瘀毒清丸高劑量組在上述指標方面均優于低、中劑量組（P＜0.01或P＜0.05）；中劑量和低劑量組比較，在血清CK、LDH方面，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），在NO、eNOS方面，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組血清CK、LDH、NO、eNOS水平比較（±s）

表2 各組血清CK、LDH、NO、eNOS水平比較（±s）

組別空白對照組模型組地拉羅司組瘀毒清丸低劑量組瘀毒清丸中劑量組瘀毒清丸高劑量組瘀毒清丸+LY294002組n 10 10 10 10 10 10 10 CK（U/L）1 024.51±106.27 2 836.48±126.35**1 283.54±136.12##2 452.17±131.23##△△1 917.26±125.65##△1 342.46±122.37##++2 797.24±134.18 LDH（U/L）915.42±87.36 2 125.37±115.24**1 472.43±107.18##1 961.28±123.54##△△1 734.35±134.41##△1 451.35±134.26##++2 102.15±175.27 NO（μmol/L）36.61±13.48 20.48±12.25**32.65±15.42##24.48±11.47#△△27.57±10.49#△30.61±13.38##++21.25±12.37 eNOS（U/L）27.82±9.37 12.57±5.14**22.76±9.35##15.37±7.59#△△17.48±8.38#△20.32±8.27##++13.46±5.16

2.3 各組血清SOD、MDA水平影響的比較 見表3。在血清SOD方面，與空白對照組比較，模型組的水平明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，地拉羅司組以及瘀毒清丸各個劑量組水平明顯上升（P＜0.01或P＜0.05）；在血清MDA方面，與空白對照組比較，模型組水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，地拉羅司組以及瘀毒清丸低、中、高劑量組水平明顯下降（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組相比，瘀毒清丸+LY294002組在血清SOD、MDA方面，差異無統計學意義（P＞0.05），說明LY294002阻斷了瘀毒清丸抑制心肌氧化應激的作用。與地拉羅司組比較，瘀毒清丸低、中劑量組血清SOD、MDA方面，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），瘀毒清丸高劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。瘀毒清丸3個劑量組比較，瘀毒清丸高劑量組在上述指標方面均優于低、中劑量組（P＜0.01或P＜0.05）；中劑量和低劑量組比較，差異無明顯統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組血清SOD、MDA水平影響的比較（±s）

表3 各組血清SOD、MDA水平影響的比較（±s）

組別空白對照組模型組地拉羅司組瘀毒清丸低劑量組瘀毒清丸中劑量組瘀毒清丸高劑量組瘀毒清丸+LY294002組n 10 10 10 10 10 10 10 SOD（U/L）126.57±17.33 65.37±10.38**90.41±12.54##72.44±10.37#△△83.26±10.51##△91.03±9.34##++67.37±10.19 MDA（μmol/L）2.42±0.48 6.28±0.25**2.57±0.33##4.29±0.45#△3.99±0.58#△2.51±0.47##++6.14±0.19

2.4 各組心肌組織P-Akt、P-eNOS、Akt、eNOS蛋白水平的比較 見圖1，表4。在P-Akt、P-eNOS蛋白方面，與空白對照組比較，模型組表達明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，地拉羅司組以及瘀毒清丸低、中、高劑量組表達明顯上升（P＜0.01或P＜0.05）。在Akt、eNOS方面，各組比較差異無明顯統計學意義（P＞0.05）。與模型組相比，瘀毒清丸+LY294002組各指標差異無統計學意義（P＞0.05），說明LY294002阻斷了瘀毒清丸增強Akt、eNOS磷酸化的作用。與地拉羅司組比較，瘀毒清丸低劑量組在P-Akt、P-eNOS蛋白方面，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），瘀毒清丸高劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。瘀毒清丸3個劑量組比較，瘀毒清丸高劑量組在P-Akt方面優于低、中劑量組（P＜0.01或P＜0.05）。

圖1 各組心肌組織P-Akt、P-eNOS、Akt、eNOS蛋白水平電泳條帶

表4 各組心肌組織P-Akt、P-eNOS、Akt、eNOS蛋白表達比較（±s）

表4 各組心肌組織P-Akt、P-eNOS、Akt、eNOS蛋白表達比較（±s）

組別空白對照組模型組地拉羅司組瘀毒清丸低劑量組瘀毒清丸中劑量組瘀毒清丸高劑量組瘀毒清丸+LY294002組n 10 10 10 10 10 10 10 P-Akt/GAPDH 0.78±0.15 0.37±0.09**0.86±0.14##0.48±0.12#△△0.69±0.17#△0.86±0.28##++0.41±0.02 Akt/GAPDH 0.93±0.09 1.02±0.18 1.06±0.15 1.02±0.12 1.14±0.17 0.96±0.10 0.96±0.13 P-eNOS/GAPDH 0.86±0.11 0.48±0.04**1.02±0.13##0.82±0.25#△1.07±0.38##1.03±0.26##0.44±0.16 eNOS/GAPDH 0.57±0.10 0.66±0.07 0.63±0.08 0.66±0.13 0.65±0.09 0.64±0.12 0.59±0.11

3 討 論

作為體內氧化反應的催化劑，鐵過載會引起線粒體功能障礙，發生氧化應激而對心肌造成損傷［8］，其不但可以誘導產生羥基自由基，還可以啟動脂質過氧化反應，從而加強心肌細胞的損傷［1］。目前，在臨床上主要使用鐵螯合劑治療鐵過載心肌損傷，包括地拉羅司、去鐵胺、去鐵酮等，其中研究表明地拉羅司的治療效果較優［9］，因此本研究選用地拉羅司作為西藥陽性對照。

在鐵過載引起的心肌損傷中，重要抗氧化酶SOD的減少和清除氧自由基能力的衰減導致了MDA的增加，進一步破壞以脂質為主要成分的生物膜的結構和功能，損傷血管內皮細胞和心肌細胞［10］。而本研究結果中瘀毒清丸明顯降低了血清中MDA的活性和提高了SOD的活性，說明瘀毒清丸抑制了氧化應激作用，從而發揮防止鐵過載誘導的線粒體功能障礙的作用。

血清肌鈣蛋白cTnT與cTnI和血清CK、LDH的水平在臨床上是用來評估心肌受損情況的標志物［11］。本研究結果表明，瘀毒清丸和地拉羅司均可明顯恢復鐵過載模型中上述指標的水平和血清鐵濃度，且與瘀毒清丸成劑量依賴性趨勢。

eNOS能通過抑制平滑肌收縮和血小板聚集來調節血管張力［12］，是調節內源性NO生成的關鍵酶，受PI3K-Akt信號通路的調控。它的具體機制是通過促進PI3K信號通路激活將Akt磷酸化從而使Akt信號通路激活［13］，Akt信號通路激活后可磷酸化eNOS并調節eNOS活性［13］。且eNOS誘導產生的NO是一種有效的血管舒張調節劑，有保護心肌細胞的作用［14］。也有研究表明，eNOS能通過調節心肌血流，介導血管對氧化應激的反應，抑制中性粒細胞黏附到血管內皮細胞上，從而發揮對心肌損傷具有保護作用［15］。瘀毒清丸的主要成分包括熟大黃、川芎、生地黃、半枝蓮、黃芩。現代研究表明，黃芩、大黃、川芎、半枝蓮［16-17］能上調內皮細胞中eNOS mRNA的表達來刺激eNOS產生NO。而本研究的結果顯示，瘀毒清丸的確能使血清中的NO、eNOS明顯增加且顯著上調了心肌組織中AktT/eNOS磷酸化水平，證明了瘀毒清丸與Akt/eNOS的相關性。相反，在給予PI3K抑制劑LY294002干預后，阻斷了瘀毒清丸對心肌損傷標志物、血動力學參數和Akt、eNOS磷酸化的影響，表明PI3K信號通路在瘀毒清丸作用于心肌損傷的過程中占據了重要地位。這些結果表明瘀毒清丸能激活eNOS依賴的PI3K-Akt信號通路且Akt激活需要通過PI3K的作用，顯示了一種新的作用機制：瘀毒清丸通過PI3K-Akt-eNOS通路保護心肌損傷。

以上均可說明瘀毒清丸具有舒張血管、減輕心肌損傷的作用。且該影響與瘀毒清丸成劑量依賴性趨勢，瘀毒清丸高劑量組部分指標改善效果有優于地拉羅司的趨勢。

綜上所述，瘀毒清丸可顯著減輕鐵過載引起的心肌損傷，并且PI3K-Akt-eNOS信號通路在此過程中，尤其是在抑制氧化應激作用方面，具有重要意義。