兩種方法檢測桶裝飲用水回收桶中銅綠假單胞菌的結果比較

◎ 朱偉珍

（廣東省汕頭市質量計量監督檢測所，廣東 汕頭 515041）

近年來，多地市場管理局對包裝飲用水的監督抽檢中發現其不合格率比較突出。其中，桶裝飲用水中銅綠假單胞菌檢出率遠高于其他包裝形式的飲用水。有調查指出，桶裝飲用水中銅綠假單胞菌超標的部分原因是回收桶清洗不充分。因受到生產工藝及生產成本的限制，目前絕大部分生產企業均采用回收桶清洗消毒再利用。回收桶在運輸、銷售以及使用過程中不可控因素較多，故此類污染難以避免[1-4]。包裝飲用水銅綠假單胞菌項目不合格的問題困擾著生產企業，實驗室也時有接到生產企業咨詢關于回收桶中污染銅綠假單胞菌的問題。在廣東省汕頭市質量計量監督檢測所開展“提質強企”質量技術幫扶的行動中，筆者實地調研了當地一家包裝飲用水生產企業，從該企業的回收桶存放場所隨機抽取6只回收桶，并對其進行銅綠假單胞菌項目檢測試驗。

我國現行銅綠假單胞菌的檢測標準有《食品國家安全標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）[5]，該方法為濾膜法，此外還有《化妝品安全技術規范》（2015年版）[6]和《一次性使用衛生用品衛生標準》（GB 15979—2002），這兩個標準的方法均為定性檢測法。由于3個標準都是對應特定的產品類型，回收桶不屬于這些產品的范圍，檢測該項目只可參考執行。本試驗采用了前兩個較新且方法不同的標準進行試驗，并對檢測結果進行分析比較，以確立一種較為適合該項目的檢測方法，幫助企業把好質量關，同時為后期開展該項目的檢測工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和標準菌株

6只回收桶是從當地一家生產企業的回收桶存放場所隨機抽取；銅綠假單胞菌ATCC 27853（廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心 食品安全菌種保藏中心）。

1.2 試劑

CN瓊脂培養基、乙酰胺肉湯、金氏B培養基、綠膿菌素測定用培養基、氧化酶試劑、十六烷三甲基溴化銨瓊脂、乙酰胺培養基、明膠培養基和營養瓊脂，均購自北京陸橋技術有限公司，驗收合格且在有效期內。

1.3 儀器與設備

YM75立式壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司）；MFS-3A-250-K不銹鋼多聯過濾系統（廣東環凱微生物科技有限公司）；BHC-1300IIA/B2生物安全柜、SW-CJ-1Cu凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；BPX-272電恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司）；WGZ-2XJ細菌濁度計（上海昕瑞儀器儀表有限公司）

1.4 試驗方法

1.4.1 樣液制備

無菌操作往6只回收桶各加入260 mL無菌PBS，清洗回收桶內壁包括桶蓋，將洗液收集于6個無菌錐形瓶備用。

1.4.2 菌懸液制備

吸取5 mL PBS加入銅綠假單胞菌標準菌株斜面（24 h新鮮培養）中，反復吹吸，洗下菌苔。用吸管吸取洗液轉移到無菌試管中，用漩渦振蕩器混合均勻后稀釋配制成菌懸液，用細菌濁度計測定濃度，用PBS稀釋制備成約103CFU·mL-1濃度備用。

1.4.3 樣品檢測

（1）濾膜法。檢測步驟參照《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016），取250 mL回收桶洗液，通過孔徑0.45 μm濾膜過濾，貼在已制備好的CN瓊脂平板上，將平板倒置于（36±1）℃培養40～48 h，并防止干燥。分3種情況進行確證試驗。①對于顯藍色或綠色（綠膿色素）的疑似菌落，需要做綠膿菌素確證試驗，陽性判為檢出。②對于產熒光不產綠膿色素的疑似菌落，進行乙酰胺肉湯確證試驗，陽性判為檢出。③對于顯紅褐色不發熒光的疑似菌落進行氧化酶測試、乙酰胺肉湯和金氏B培養基確證試驗，試驗均為陽性結果判為檢出。根據以上3種情況計算每250 mL水樣中銅綠假單胞菌的數量。

（2）定性檢測法。檢測步驟參照《化妝品安全技術規范》（2015年版），取10 mL回收桶洗液加入 90 mL SCDLP液體培養基中，置于（36±1）℃恒溫培養18～24 h后，劃線分離于十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板和乙酰胺培養基平板，如有可疑菌落，進行染色鏡檢、氧化酶、綠膿菌素、硝酸鹽還原產氣、明膠液化和42 ℃生長確證試驗。經證實為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶及綠膿菌素皆為陽性者，即可報告檢出；如綠膿菌素為陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和42 ℃ 生長三者皆為陽性，仍可報告檢出銅綠假單胞菌。

1.4.4 加標檢測

取制備成約103CFU·mL-1濃度標準菌株菌懸液，吸取0.1 mL加入260 mL無菌PBS中，根據梯度稀釋，制作加標試驗。按1.4.3進行檢測。

1.4.5 菌懸液實際濃度活菌計數

取制備成約103CFU·mL-1濃度標準菌株菌懸液，吸取1 mL作適當稀釋后，各接種兩個營養瓊脂平板和CN瓊脂平板，同時設空白對照，培養后，進行活菌計數。

2 結果與分析

2.1 樣品檢測結果

由表1可知，使用濾膜法檢測，1#、3#、6#回收桶洗液濾膜上各有4個、11個、9個顯藍綠色的典型菌落，經綠膿菌素確證試驗，結果均為陽性判為檢出；2#、4#、5#和6#存在其他可疑的菌落，挑取菌落進行確證試驗，結果非銅綠假單胞菌。使用定性檢測法，1#、3#、6#回收桶洗液檢出銅綠假單胞菌，其他洗液未檢出。結果表明，濾膜法和定性檢測法檢測結果一致。

表1 兩種方法銅綠假單胞菌檢測結果表

由于回收桶的材質及結構上的特殊，試樣處理方式不適合采用剪碎或擦拭，因此使用無菌PBS清洗后取洗液檢測較為合適。本次試驗同時采用兩種方法，因每個回收桶樣品都具備唯一性，只能用260 mL無菌PBS清洗回收桶內壁包括桶蓋，將其作為樣液進行試驗。當實際檢測只采用一種方法時，應按采用的標準來處理樣液。濾膜法取250 mL回收桶洗液進行過濾后培養檢測，定性檢測法取10 mL洗液進行前增菌，使銅綠假單胞菌在低濃度時也可檢出。此外，需注意使用清洗回收桶的無菌PBS不能過少，因回收桶較大，少量液體無法將桶內壁清洗干凈，可能影響檢測結果。對于濾膜法的檢測結果，用250 mL和260 mL差別不大，如要準確計算可將檢測結果乘以1.04。采用定性檢測法時，建議在劃線分離時先觀察SCDLP增菌液的現象，當較為清澈時應適當延長至標準規定的最長時間24 h或26 h，使菌在增菌液中充分生長再取其劃線分離，避免樣液菌量濃度太低且未充分繁殖出現假陰性。

2.2 加標的檢測結果

由表2可知，加入最高濃度約103CFU·mL-1的標準菌株菌懸液的濾膜上長有78個典型藍綠色菌落，加入濃度4×10-1CFU·mL-1（以103CFU·mL-1為原液進行稀釋）的標準菌株菌懸液的濾膜上長有1個典型藍綠色菌落。用定性檢測法在5×10-1、6×10-1梯度未檢出銅綠假單胞菌，其他稀釋梯度都檢出。結果表明，濾膜法可檢測低濃度至1 CFU/250 mL，定性檢測法同樣檢出，結果一致。結合表1的試驗結果可知，加標檢測結果濃度涵蓋了樣品檢測結果，推測不會出現漏檢情況。

表2 銅綠假單胞菌加標檢測結果表

2.3 菌懸液實際濃度活菌計數結果

用營養瓊脂傾注平皿的103CFU·mL-1的標準菌株菌懸液實際濃度活菌計數800 CFU·mL-1，用CN瓊脂傾注平皿計數為820 CFU·mL-1，空白無菌生長。計算濾膜法第1梯度吸取0.1 mL 103CFU·mL-1菌懸液過濾后結果為78 CFU·mL-1，相當于理論數量乘以10倍即為 780 CFU·mL-1。結果表明，用兩種不同培養基傾注的結果與濾膜過濾的結果無明顯區別，這可能與兩種不同培養基均適合銅綠假單胞菌生長有關，銅綠假單胞菌在基本相同的環境下形成菌落的能力比較接近，且加入的菌液為24 h新鮮培養，菌的生長活力較強。試驗的實際研究并不在此，僅作為試驗的參考，實際目的在于觀察菌懸液實際濃度與回收率（達95%以上），驗證試驗的準確性。空白無菌生長代表試驗并沒有受到污染，試驗結果有效。

3 結論與討論

銅綠假單胞菌是一種重要的水源和食源性條件致病菌，屬于革蘭氏陰性細長桿菌，大小為（1.5～3.0）μm× （0.5～0.8）μm，廣泛分布于自然界，較其他細菌對消毒劑、干燥、紫外線的抵抗力強，在常溫的水中可以存活數月。該菌幾乎可以感染人體的任何組織和部位，可引起化膿性感染、菌血癥、急性腸道疾病和皮膚炎癥等。隨著我國對銅綠假單胞菌的致病性及危害認識的不斷深入，國家制定了相關政策。其中，《食品國家安全標準 包裝飲用水》（GB 19298—2014）[7]于2015年5月24日起正式實施。該標準明確規定銅綠假單胞菌是必檢項目之一且不得檢出。由本次試驗結果可知，確實存在桶裝飲用水回收桶銅綠假單胞菌污染的問題。雖然本次試驗污染銅綠假單胞菌的回收桶最少只有4 CFU，但一旦使用受污染的回收桶裝水銷售，水可提供有利于銅綠假單胞菌生長繁殖的條件，且隨著存放時間的延長，水的銅綠假單胞菌污染會越來越嚴重。包裝飲用水生產企業要生產合格的水，必須從水的源頭到成品的每個環節層層把關，包括對回收空桶及桶蓋進行徹底清洗消毒。檢測回收桶中銅綠假單胞菌的方法必須以最嚴格的要求執行。因此，有必要通過試驗確立一種適合桶裝飲用水回收桶中銅綠假單胞菌的檢測方法。

本次試驗參照我國現行標準《食品國家安全標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）和《化妝品安全技術規范》（2015年版）對桶裝飲用水回收桶中銅綠假單胞菌項目進行檢測。前者為濾膜法，又稱薄膜過濾法、膜過濾法、濃縮法，是以微孔濾膜截留液體樣品中的微生物，并直接在濾膜上進行培養的微生物檢驗方法[8]。該方法的特點是大幅增加了取樣量，能全面反映出樣品中微生物的數量。銅綠假單胞菌的菌體最小為7.5 μm，標準方法中使用孔徑0.45 μm的濾膜過濾樣液，完全可以將其截留，檢測結果可靠。后者為定性檢測法，定性檢測法也可稱為“增菌培養法”，該方法是通過將樣品處理液加入到適用于目標菌生長繁殖的液體培養基，借助人為創造的培養條件（如培養溫度）使其快速生長繁殖的方法。該方法的特點是只要檢測對象含有較少的目標菌，都能進行增菌繁殖，檢出率極高。由本次試驗可知，用濾膜法250 mL只檢出1 CFU濃度的樣液取10 mL進行前增菌，相當于取理論數量為0.04 CFU的菌通過增菌培養就可以檢出目標菌，驗證了該方法對目標菌濃度要求極低的特點。但該方法在菌量濃度過低的情況下，須延長增菌時間避免樣液菌量濃度過低且未得到充分繁殖出現假陰性，且該方法只能達到定性檢測，無法得到銅綠假單胞菌的準確數量。

《食品國家安全標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）的濾膜法和《化妝品安全技術規范》（2015年版）的定性檢測法都是嚴謹可行的方法，兩種方法各有特點，前者更貼合實際使用情況且更能夠體現污染程度。