超聲波-微波協同萃取豆蔻明工藝研究

◎ 劉佳哲，吳小芝，路 暢，張東娜，姜曉坤

(吉林農業科技學院，吉林 吉林 132001）

草豆蔻為姜科山姜屬植物草豆蔻的干燥近成熟種子，味辛、性溫，具有去異增香的作用。草豆蔻一般作為食品香辛料添加劑，適用于香辛料和調味品的生產、流通、使用[1-2]。草豆蔻中含有的豆蔻明具有抗炎、抗菌、抗血小板聚集、抗氧化等多種生物活性[3-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

草豆蔻（市購，無腐爛變質）；動物血液（市購)；無水乙醇（天津市鼎盛鑫化工有限公司）；豆蔻明標準品（上海源葉生物科技有限公司）。

1.1.2 試驗儀器

AL-2045電子天平（上海菁海儀器有限公司）；HH-4恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；SY-720超聲波清洗機（昆山超聲儀器公司）；BCD-221WDPT冰柜（青島海爾股份有限公司）；DHL-820A恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；H2050R高速冷凍離心機（湖南湘儀試驗室儀器開發有限公司）；UV-721PC紫外分光光度計（上海馳唐儀器設備有限公司）；微波爐。

1.2 豆蔻明提取的操作流程

①篩選草豆蔻、烘干。將購買的草豆蔻用清水洗凈，去除雜質，放入65 ℃干燥箱內烘干。②粉碎、過篩。將烘干的的草豆蔻放入粉碎機中粉碎，過篩。③稱重。稱取草豆蔻粉末20 g。④超聲波-微波輔助提取。設置超聲波功率600 W，超聲波時間12 min，微波功率600 W，微波時間80 s。⑤過濾。將提取液用濾紙過濾。⑥濃縮。將濾液放入蒸發皿用水浴鍋將濾液濃縮。⑦純化。利用大孔吸附樹脂的特性將濃縮物進行純化。⑧干燥。將純化后的待測物進行濃縮干燥。⑨將0.01 g粗制豆蔻明溶于80%的乙醇溶液中制成標準溶液，按照標準曲線制備方法測定吸光度，帶入標準曲線，計算出豆蔻明的濃度。

1.3 標準溶液的配制

精確稱取0.01 g豆蔻明標準品制成0.1 mg·mL-1的豆蔻明標準溶液，分別吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL于試管中，用蒸餾水補至2 mL，搖勻后在波長346 nm處測定吸光度值，橫坐標為豆蔻明濃度，縱坐標為吸光度值，得到標準曲線。

取純化前樣品溶液5 mL稀釋1倍后，在波長 346 nm處測定吸光值，將測得的吸光度帶入標準曲線中，獲得豆蔻明濃度。

1.4 豆蔻明含量計算

豆蔻明含量（mg·g-1）計算公式為

式中：c為樣品中豆蔻明濃度，mg·mL-1；f為稀釋倍數；V為待測樣溶液體積，mL；m為草豆蔻粉末的質量，g。

1.5 單因素試驗

（1）不同乙醇體積分數對豆蔻明含量的影響。固定超聲波功率600 W、超聲波時間10 min、微波功率200 W、微波時間60 s，考察乙醇體積分數（20%、40%、60%、80%和100%）對豆蔻明含量的影響。

（2）不同超聲波功率對豆蔻明含量的影響。固定乙醇體積分數80%、超聲波時間10 min、微波功率200 W、微波時間60 s，考察超聲功率400 W、500 W、600 W、700 W和800 W對豆蔻明含量的影響。

（3）不同超聲時間對豆蔻明含量的影響。固定乙醇體積分數80%、超聲波功率600 W、微波功率240 W、微波時間60 s，考察超聲時間6 min、8 min、10 min、12 min和14 min對豆蔻明含量的影響。

（4）不同微波功率對豆蔻明含量的影響。固定乙醇體積分數80%、超聲波功率600 W、超聲波時間12 min和微波時間60 s，考察微波功率分別為300 W、400 W、500 W、600 W和700 W對豆蔻明含量的影響。

（5）不同微波時間對豆蔻明含量的影響。固定乙醇體積分數80%、超聲波功率600 W、超聲波時間12 min和微波功率600 W，考察微波時間20 s、40 s、60 s、80 s和100 s對豆蔻明含量的影響。

1.6 豆蔻明的定性分析

分別移取3.0 mL 0.1 mol?L-1的豆蔻明標準乙醇溶液和提取出的溶液于兩只比色管中，在268 nm到 465 nm間掃描得到紫外吸收光譜，掃描對照兩者的吸收光譜。

1.7 響應面試驗

根據單因素試驗結果，選擇3個對豆蔻明含量影響最大的因素做響應面試驗，確定最優的豆蔻明提取條件。

1.8 豆蔻明與抗血小板聚集活性的研究

取動物血漿，用質量分數為3.8%枸櫞酸鈉抗凝，在800 r·min-1下離心10 min，制備富血小板血漿。分別在測定管中加入265 μL 富血小板血漿，分別加入豆蔻明和阿司匹林至溶液終濃度分別為0.1 mmol·L-1，溫孵5 min，加入5 μL二磷酸腺苷，用質量分數為1%的二甲基亞砜作空白，觀察記錄5 min內最大聚集率，計算豆蔻明和阿司匹林對二磷酸腺苷誘導的血小板聚集的抑制率，計算公式為

2 結果與分析

2.1 繪制標準曲線

將1.3中的系列標準溶液在波長346 nm處測定吸光度值，橫坐標為豆蔻明濃度，縱坐標為吸光度值，得到標準曲線，見圖1。由圖1可知，y=88.757x+0.0293，R2=0.9997，線性關系良好。

圖1 豆蔻明的標準曲線圖

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 不同乙醇體積分數對提取液中豆蔻明含量 的影響

由圖2可知，豆蔻明的含量隨著乙醇體積分數的增加而增加，在乙醇體積分數為80%時達到最高值，然后逐漸降低，通過分析，選擇乙醇體積分數為60%、80%、100%進行響應面試驗。

圖2 乙醇體積分數對提取液中豆蔻明含量的影響圖

2.2.2 不同超聲波功率對豆蔻明含量的影響

由圖3可知，隨著超聲波功率的升高，提取液中豆蔻明含量逐漸增加，當超聲波功率達到600 W時，豆蔻明提取率達到最高；超過600 W后，隨著超聲波功率的升高，豆蔻明的提取率逐漸降低。由此選擇超聲波功率600 W較好，并選擇500 W、600 W、700 W進行響應面試驗。

圖3 超聲波功率對提取液中豆蔻明含量的影響圖

2.2.3 不同超聲波時間對提取液中豆蔻明含量的影響

由圖4可知，隨著超聲波時間的延長，豆蔻明含量逐漸增加，當達到8 min時，豆蔻明提取率達到最高，超過8 min后，隨著時間的延長豆蔻明的提取率逐漸降低。因此，超聲波時間選擇8 min。

圖4 超聲波時間對提取液中豆蔻明含量的影響圖

2.2.4 不同微波功率對提取液中豆蔻明含量的影響

由圖5可知，隨著微波功率的升高，豆蔻明的含量逐漸增加，當微波功率達到600 W時，豆蔻明含量達到最高，超過600 W后微波功率升高，豆蔻明含量逐漸降低。由此選擇微波功率600 W較好，并選擇500 W、600 W、700 W進行響應面試驗。

圖5 微波功率對提取液中豆蔻明含量的影響圖

2.2.5 不同微波時間對提取液中豆蔻明含量的影響

由圖6可知，隨著微波時間的延長，豆蔻明含量逐漸增加，當達到80 s時，豆蔻明含量達到最高，超過80 s后，隨著時間的延長，豆蔻明的含量逐漸降低。因此，微波時間選擇80 s。

圖6 微波時間對豆蔻明含量的影響圖

2.3 豆蔻明的定性分析

分別移取3.0 mL 0.1 moL·L-1的豆蔻明標準品、乙醇溶液和樣品提取液于兩支比色管中，在268 nm到 465 nm間掃描得到紫外吸收光譜，掃描對照兩者的吸收光譜。由圖7、圖8可知，待測樣的掃描光譜與豆蔻明標準品的掃描光譜中，主要波峰基本吻合，可證明待測樣中含有豆蔻明。

圖7 豆蔻明標準品掃描光譜圖

圖8 待測樣品掃描光譜圖

2.4 響應面試驗

根據單因素試驗結果，選擇微波功率、超聲波功率、乙醇體積分數這3個對豆蔻名含量影響最大的因素做響應面試驗，確定最優的豆蔻明提取條件，響應面試驗因素水平見表1。利用Box-Behnken試驗設計，確定3因素3水平共17組試驗，試驗設計及結果見 表2，以吸光度為響應值做響應面試驗。由表3可知，模型P值＜0.0001，失擬項P值=0.0894，說明該模型擬合程度較好。AC、A2、B2、C2均達到極顯著 水平。

表2 響應面試驗結果表

表3 Box-Behnken Design分析試驗數據表

由Box-Behnken回歸分析，得到多元二次響應面回歸模型為Y=2.54+0.060A-0.029B-0.073C-0.012AB-0.21AC-0.014BC-0.65A2-0.83B2-0.68C2，其決定系數R2=0.9990，說明回歸方程擬合度很好，98%的吸光度值與各因素變量之間關系可以用此模型解釋，且調整決定系數R2adj=0.9977與R2接近，表明實測值和模型預測值具有較好的相關性。預測決定系數R2pred=0.9863，表明該模型可以預測98.63%的吸光度值與各因素變量之間關系。根據二次回歸方程預測求極值得：當乙醇提取分數為81.116%、超聲波功率為598.225 W、微波功率為593.842 W時，吸光度有最大值為2.548。結合操作可行性，將工藝條件調整為乙醇體積分數80%，超聲波功率600 W，微波功率 600 W。對最佳試驗條件進行驗證，豆蔻明提取液吸光度為2.542，與理論值相比，誤差為0.1%，響應面法優化結果準確、可靠。各因素對吸光度影響的響應面和等高線圖見圖9。

圖9 各因素對吸光度影響的響應面和等高線圖

2.5 豆蔻明與抗血小板聚集活性的研究

由表4知，豆蔻明對于抑制血漿中的血小板的聚集有一定的效果，但是效果不如阿司匹林。

表4 不同時間下血漿中加入藥品后的透射比表

3 結論

本文是關于超聲微波協同萃取草豆蔻中豆蔻明及其與血小板聚集活性的研究。利用超聲波和微波的空化作用對豆蔻明進行提取并以此為原料進行豆蔻明與抗血小板聚集活性相互作用的研究，操作技術簡單，提取效率高，能大大縮短提取時間。通過定性試驗的結果可以得出，試驗所萃取的提取液中確實含有豆蔻明。響應面試驗結果表明，對于草豆蔻中的豆蔻明的最佳萃取條件為乙醇分數80%，超聲波功率600 W，超聲波時間8 min，微波功率600 W，微波時間80 s。由豆蔻明與抗血小板聚集活性研究試驗可以得出，豆蔻明對血小板聚集有部分抑制效果。