PCR檢驗的質量控制

◎ 徐 楓，艾 萍，金 浩，劉 卓，陳振宇，趙 詠

（1.錦州市疾病預防控制中心，遼寧 錦州 121000；2.錦州市第二醫院，遼寧 錦州 121000；3.錦州市婦嬰醫院，遼寧 錦州 121000；4.錦州醫科大學，遼寧 錦州 121000）

食品的安全問題一直是社會關心的熱點，它直接關系到公眾的身體健康以及生命安全，并對國民經濟的發展以及社會的穩定產生影響。PCR技術以其高特異性、高靈敏性和簡便快捷的特點，為食品安全與質量安全問題提供科學依據。但PCR要求比較嚴格，容易造成實驗污染和操作污染引起的假陽性結果。如果擴增儀溫度不準確、反應液處理不好，會導致PCR抑制物進入反應體系且出現假陰性結果。為保證PCR檢驗結果的準確性，做好PCR的質量控制至關重要。影響PCR檢驗質量的因素很多，總體上涉及以下幾個方面。

1 實驗室設置設施

PCR反應是一種廣泛用于使特定DNA或RNA樣本快速生成數百萬至數十億個拷貝的方法。在擴增過程中，會產生大量的擴增產物，如果控制不好極易造成實驗室污染。為防止這種污染的發生，需要對實驗室進行合理分區。標準的PCR實驗室分為相互獨立的4個區域，涵括試劑準備區、樣品制備區、擴增區以及產物分析區[1]。各工作區域有明確的標識，各區的實驗物品不得混用，應貼上不同顏色標識予以區別。進入各工作區域必須嚴格按照試劑準備區、樣品制備區、擴增區、產物分析區方向依次進行，避免造成 交叉污染。

2 人員管理

實驗人員要具有相關的專業知識及2年以上的檢驗工作經歷，具備熟練的技術操作和正確分析判斷實驗結果的能力。應定期對實驗人員進行專業知識和安全知識的培訓，做好人員的能力評估。

3 性能驗證

開展新的檢驗前，對提取和擴增設備、提取和擴增試劑在內的全套實驗室檢驗系統進行全面的性能驗證。增加新的檢驗設備、更換提取和擴增試劑廠家、儀器設備進行大維修及更換關鍵部件等可能會影響到性能時也需要進行驗證，驗證一般包括以下幾種方法。

（1）方法符合率。選取陰性樣本5例，陽性樣本10例，按照樣本檢驗程序，所得結果與預期結果相比較，計算符合率（表1）。陰性樣本及陽性樣本的符合率應達到100%。

（2）檢出限。使用定值標準物質，稀釋至廠家聲明的檢出限濃度，重復測定5次，必須100%檢出靶核酸。或在不同批次內對該濃度樣本進行20次重復測定，必須檢出至少18次靶核酸。

（3）抗干擾能力。在弱陽性樣本（弱陽性質控品）中加入干擾物質（如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、免疫球蛋白G、類風濕因子和藥物等）溶液，使得干擾物質的終濃度與廠家聲明的濃度相同[2]。與常規樣本一樣處理，對照組加入等量的溶劑，至少重復測定3次以上，弱陽性樣本檢驗仍為弱陽性結果，則驗證通過。通過表2的實驗結果可以得出SARS-CoV-2 RNA對血紅蛋白、白蛋白、利巴韋林+阿奇霉素具有抗干擾能力。

表2 抗干擾能力實驗結果表

（4）交叉反應。應驗證與檢測對象可能存在交叉反應的核酸物質對檢測的影響。主要指與檢測對象核酸序列具有同源性，易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸。例如，取含冠狀病毒假病毒陽性樣本的分析特異性參考品（如國際參考品、國家參考品、廠家參考品）與常規陰性樣本一樣處理，至少重復檢驗3次結果都為陰性，則交叉反應驗證合格。交叉反應實驗結果見表3。

表3 交叉反應實驗結果表

（5）正確度。參加國家組織的實驗室間質量評價或與同級別或高級別的機構進行實驗室間比對，至少包括異常值和正常值的5份樣品，以≥80%的結果在規定范圍內為正確度驗證通過。

（6）重復性。選擇至少兩個水平穩定的評價樣本，同一批次內對樣本進行20次重復測定。實驗過程中應至少檢驗一個質控品。依據兩組實驗數據（水平1、2），分別計算結果的均值、標準差和變異系數。以能力驗證/室間質評評價界限（靶值±lg0.4）作為允許總誤差（TEa），要求重復性精密度＜3/5 TEa（0.24），中間精密度＜4/5 TEa（0.32）[3]。

4 儀器設備

實驗室必須有質量可靠的儀器設備，以保證檢驗質量。溫度偏離程序設定的目標值對PCR擴增效果有一定影響，對于低含量的模板樣品，溫度偏差可能導致陰陽性的結果改變。因此，實驗室應該固定日期對PCR儀的反應孔進行溫度校準以及期間核查，還需要對PCR檢驗相關的儀器設備進行檢定校準，保證所出數據的準確，同時規范儀器設備的使用和維護[4]。

5 試劑和關鍵耗材

試劑應有專人保管，在有效期內使用，按照其規定的保存要求存放。試劑批間比對，一般選取5個舊批次試劑檢驗過的樣品，覆蓋測量區間（包括陰性、臨界值、低值、中值和高值），用新批次試劑進行檢驗。對兩批次檢驗結果進行偏差計算分析，至少有4個樣品結果偏差小于±7.5%，且陰性和臨界值樣本符合預期，則提示兩批次試劑批間差異符合要求[5]。

耗材的質量也會影響PCR的檢驗結果，關鍵耗材應不含抑制物，必須使用帶濾芯的吸頭，但不能使用玻璃離心管，避免造成泄露。樣品采集管和PCR反應管管帽應密閉完好，防止產生氣溶膠。

6 對標本的要求

標本的采集時間、采樣量和采樣容器嚴格按照標準要求執行。采樣所用的抗凝劑及相關試劑材料不應對核酸擴增及檢驗過程造成干擾。所有標本采集后，應盡快送往實驗室，標本在室溫（25 ℃）放置不宜超過4 h。如果需要長途運輸，采用干冰等制冷方式進行保藏，標本運送期間避免反復凍融。

7 實驗室間質量評價

實驗室要經常參加實驗室間比對和能力驗證，通過實驗室間比對和能力驗證評價參加者的能力，監測檢驗結果的準確性，提高實驗室的檢驗能力。

8 結語

PCR檢驗的質量控制是實驗室的核心活動，要做好質量控制，最重要的是要了解影響檢驗質量的所有因素，控制好這些影響因素，對出具準確的檢驗結果可以起到至關重要的作用。