基于HPLC-MS/MS法的腦靈素制劑中人參摻偽檢查研究

穆向榮，徐興燕，焦陽，許麗麗,2，尹雪，林永強*，林慧彬

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局膠類產品質量評價重點實驗室，中藥標準創新與質量評價工程實驗室，中藥配方顆粒共性技術山東省工程研究中心，山東 濟南 250101；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；3.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014)

腦靈素系列制劑包括片劑和膠囊劑2種劑型，處方組成一致，均由人參、鹿茸、黃精、淫羊藿等十五味藥組成，具有補氣血，健腦安神的功效。處方中人參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根和根莖，具有大補元氣，復脈固脫等功效[1]。近年來，多次報道西洋參冒充人參進行含人參制劑的投料生產[2-3]。西洋參為五加科植物西洋參(P.quinquefoliumL.)的干燥根，具有補氣養陰，清熱生津的功效[1]。兩味藥材性味、臨床應用和功能主治互不相同，所含皂苷種類與含量及比例有一定的差異[4-9]，若用西洋參摻入人參或直接充作人參進行投料生產，可能會影響制劑的有效性。研究發現西洋參中擬人參皂苷F11含量較高，而人參中基本不含，因此，擬人參皂苷F11可作為非法投料使用的依據。

1 儀器、試劑與樣品

儀器：AB SCIEX Triple Quad 6500+高效液相色譜-質譜聯用儀；島津8050三重四級桿串聯質譜儀；Sartorius CP225D電子天平。

試劑：乙腈、為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

對照品：擬人參皂苷F11(中國食品藥品檢驗研究院提供，批號：110841-201617；上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號：3711；成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-21051408；上海甄準生物科技有限公司，批號：22B211-B2)。

參比樣品及陰性對照樣品：本課題組按照規定的處方量及工藝自制腦靈素膠囊、片各1批，作為參比樣品使用；自制缺人參藥味的腦靈素膠囊、片各1批，作為陰性樣品使用。

人參、西洋參購于河北安國中藥材市場，經宋希貴主任中藥師鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(色譜柱內徑2.1 mm)；以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫程序見表1；流速為0.35 mL·min-1；柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質譜條件 電噴霧負離子模式(ESI-)，進行多反應監測(MRM)。質譜參數詳見表2。

表2 監測離子對、去簇電壓、碰撞能量

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱取擬人參皂苷F11(中國食品藥品檢驗研究院提供，批號：110841-201617)10.79 mg，置100 mL量瓶中，加20%乙腈使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為擬人參皂苷F11對照品貯備溶液(C濃度=0.107 9 mg·mL-1)。精密量取適量，用20%乙腈稀釋制成每1 mL含4 ng的溶液，即得。

精密稱取不同來源的擬人參皂苷F11對照品(上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號：3711；成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-21051408；上海甄準生物科技有限公司，批號：22B211-B2)適量，同法制備對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 取腦靈素片適量，除去糖衣；或取腦靈素膠囊內容物適量，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，置80 ℃水浴中加熱回流75 min，取出，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 測定 分別精密吸取上述對照品及供試品溶液各5 μL，注入液相色譜-質譜聯用儀，測定。

3 方法學驗證

3.1 專屬性實驗 擬人參皂苷F11對照品溶液制備：照“2.3.1”項下的對照品溶液制備方法制備。

陰性對照溶液的制備：取人參陰性樣品1 g，按“2.3.2”項下供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。

參比溶液的制備：取參比樣品1 g，按供試品溶液的制備方法制得參比溶液。

陽性對照溶液的制備：取人參陰性樣品1 g和西洋參6.7 mg(相當于1 g制劑中人參藥材的處方量)，制備陽性制劑，再按供試品溶液的制備方法制得陽性樣品溶液。

西洋參供試品溶液的制備：取西洋參6.7 mg，按供試品溶液的制備方法制得西洋參樣品溶液。

分別精密吸取上述溶液各5 μL，注入液相色譜-質譜聯用儀，測定。結果發現參比樣品和陰性樣品均未檢出擬人參皂苷F11成分，陽性樣品和西洋參藥材中均檢出擬人參皂苷F11成分，說明腦靈素制劑中其他藥味對測定無干擾。選擇離子色譜圖見圖1。

圖1 專屬性試驗 (自上往下依次為：擬人參皂苷F11對照品、陰性樣品、參比樣品、陽性樣品、西洋參藥材；左側為m/z 799.6→653.6離子，右側為m/z 799.6→491.6離子)

3.2 基質效應考察 腦靈素制劑處方復雜，藥味較多，且處方中人參投料量較低，故需對制劑基質效應考察。試驗中，以自制參比樣品按“2.3”項下供試品溶液的制備方法得到基質溶液2 mL，精密加入2.158 μg·mL-1人參皂苷F11對照品溶液10 μL，混勻，即得含107.9 ng·mL-1擬人參皂苷F11的基質溶液。再用20%乙腈溶液制的相同濃度的擬人參皂苷F11溶液，同時進樣比較。結果表明，腦靈素樣品基質溶液使待測成分的響應值明顯降低，基質效應明顯。在限度制定和相關方法學考察時應考慮基質效應，結果見表3、圖2。

表3 基質效應考察數據

圖2 基質考察試驗 (上圖為20%乙腈溶液，下圖為腦靈素樣品基質；左側為m/z 799.6→653.6離子，右側為m/z 799.6→491.6離子)

3.3 精密度試驗 精密吸取濃度為43.16 ng·mL-1的擬人參皂苷F11對照品溶液5 μL，注入液相色譜-質譜聯用儀，連續進樣6次，進行測定。結果表明，儀器精密度良好。

3.4 重復性試驗 選取陽性樣品(批號：200403)，按“2.3.2”項下供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取5 μL，注入液相色譜-質譜聯用儀，測定，以m/z 799.6→653.6離子峰面積值，計算重復性。結果顯示，方法重復性良好。

3.5 回收率試驗 考慮到基質效應對待測成分峰面積影響大，本實驗室以自制參比樣品按“2.3.2”項下供試品溶液的制備方法得到基質溶液，以此來制備系列對照品溶液(10.79、21.58、43.16、107.9、215.8、431.6 ng·mL-1)。精密吸取上述系列基質對照品溶液各5 μL，注入液相色譜-質譜聯用儀，測定。以m/z 799.6→653.6離子峰面積值為縱坐標，以擬人參皂苷F11濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果可見，擬人參皂苷F11濃度在10.79～431.6 ng·mL-1范圍內與峰面積積分值線性關系良好，回歸方程Y=461.68X-1 797.7,r=0.999 2。

將重復性項下樣品測定峰面積帶入上述回歸方程計算含量為11.83 μg·g-1。取同批次陽性樣品0.5 g，平行制備6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加80%甲醇25 mL，再分別精密加入1.079 μg·mL-1的擬人參皂苷F11對照品溶液0.5 mL，稱定重量，置80 ℃水浴中加熱回流75 min，取出，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。精密吸取5 μL，注入液相色譜-質譜聯用儀，測定m/z 799.6→653.6離子峰面積值，計算回收率。

結果顯示，回收率平均值為99.3%，RSD為45%方法精密度良好。

3.6 穩定性考察 取4.316 ng·mL-1的擬人參皂苷F11對照品溶液，分別于制備后0、8、12、16、20、24 h進樣，以m/z 799.6→653.6作為檢測離子對進行測定。取陽性樣品，按“2.3.2”項下供試品溶液制備方法制備，常溫保存，分別于制備后0、8、12、16、20、24 h進樣，以m/z 799.6→653.6，作為檢測離子對進行測定。

結果表明，對照品溶液和供試品溶液在24 h內穩定性良好，可以滿足檢測需要。

3.7 檢測限 以響應值相對較低的m/z 799.6→491.6作為檢測離子進行檢測，濃度為0.025 18 ng·mL-1的擬人參皂苷F11對照品溶液上述離子的信噪比約為3。

3.8 色譜柱耐用性試驗 對不同色譜柱型號進行了考察，結果顯示，3種型號的色譜柱均能實現擬人參皂苷F11的測定，該方法對色譜柱耐用性良好，結果見表4和圖3。

表4 不同型號色譜柱考察

圖3 色譜柱考察選擇離子流色譜圖 (自上往下依次為：色譜柱編號1、2、3；左側為m/z 799.6→653.6離子，右側為m/z 799.6→491.6離子)

3.9 儀器耐用性試驗 為了適應不同靈敏度的儀器，考察本方法在島津8050三重四級桿串聯質譜儀和AB 6500+高效液相色譜-質譜聯用儀上的重現性，離子流色譜見圖7～8。結果表明擬人參皂苷F11成分在上述儀器上可檢出，本方法對儀器耐用性良好。

3.10 摻偽比例考察 據研究報道，人參藥材中可檢測出少量擬人參皂苷F11，其含量遠低于西洋參。同時也存在由于客觀原因，人參中混入少量西洋參的情況，因此對人參中摻入不同比例西洋參后的制劑檢測情況進行考察。

將人參藥材中加入適量西洋參，分別制成含3%、5%、10%西洋參的人參混合樣品，分別稱取上述人參混合樣品6 mg，再加入腦靈素陰性對照樣品1 g，混勻，按“2.3.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液。分別精密吸取上述溶液各5 μL，注入液相色譜-質譜聯用儀，測定。

結果顯示，當人參中西洋參摻入量為3%、5%時，響應值相對較低的m/z 799.6→491.6檢測離子信噪比均小于3，視為未檢出；當摻入量為10%時，m/z 799.6→491.6檢測離子信噪比大于3，視為檢出。

4 結果測定

按照上述擬定檢驗方法，對66批腦靈素制劑樣品進行檢查，結果36批樣品檢出擬人參皂苷F11成分，檢出率為54.5%，結果見表5。

表5 腦靈素制劑擬人參皂苷F11檢查結果

表5(續)

5 討論

5.1 不同來源對照品對檢出結果的影響 為保證檢測結果的準確性，分別用不同來源的擬人參皂苷F11對照品配制對照品溶液，對66批腦靈素制劑樣品進行檢查，擬人參皂苷F11檢出結果一致，說明不同來源的對照品對樣品檢出結果無影響。

5.2 結果分析 現行版藥典規定的人參與西洋參來源不同，兩味藥材性味、臨床應用和功能主治互不相同，所含皂苷種類與含量及比例有一定的差異。前期調研發現，不法商家用西洋參邊角料冒充人參，用于含人參的中藥制劑。若用西洋參摻入人參或直接充作人參進行投料生產，可能會影響制劑的有效性。本試驗建立的液質聯用的檢查方法能夠準確判定腦靈素制劑中是否存在西洋參邊角料冒充人參使用的問題，可為腦靈素類制劑質量標準的完善提供參考。