基于網絡藥理學對參麥注射液緩解CIPN作用機制分析

高叢，竇明金，隋繼英

(山東第一醫科大學第三附屬醫院<山東省醫學科學院附屬醫院>，山東 濟南 250031)

化療所致周圍神經毒性(chemotherapy-induced peripheral neurotoxicity，CIPN) 是目前臨床廣泛使用的鉑類、紫杉烷類、長春堿類等化療藥物常見不良反應，其主要癥狀表現為針刺樣疼痛、燒灼感、手足麻木及觸覺減弱等。據報道20%～40%癌癥患者使用具有神經毒性的化療藥物后會出現不同程度的CIPN[1]。CIPN可在化療期間急性發生，患者無法耐受時會減少化療藥物劑量或停止化療，干擾正常治療；同時對少部分患者可能造成永久性損害。CIPN發生機制錯綜復雜，目前尚無統一結論。目前有研究報道[2]其可能與膠質細胞活化、線粒體功能障礙、氧化應激、離子通道改變、脫髓鞘、細胞修復系統改變、DNA損傷、炎癥因子、下行抑制系統功能降低和神經膠質細胞活化等多種機制有關[3]。目前對于CIPN患者的治療選擇十分有限，一般通過減少劑量或停止化療來進行急性管理，尚未發現有效的治療手段[4]。目前臨床常用預防和緩解CIPN的主要藥物有：神經生長因子及細胞保護劑類、抗氧化劑類、維生素類、核苷酸類、鈣鎂合劑等[5]。

目前大量臨床研究轉向關注傳統中醫藥在降低神經毒性方面產生的作用，以期改善患者生活質量、提高患者對化療的耐受性和依從性。參麥注射液是參麥方的一種臨床應用形式，源于古方“生脈散”的衍變，由傳統中藥紅參與麥冬兩味藥組成，主要活性成分為人參皂苷、麥冬皂苷和少量的麥冬多糖等。中醫理論認為參麥方有益氣固脫、養陰生津之功效[6]。參麥注射液臨床應用于多種疾病，包括病毒性心肌炎、冠心病和粒細胞減少癥等，也常與化療藥物同用，提高機體免疫力，起到增效減毒的作用。近年來對中藥注射劑成分作用的研究愈加深入，其中人參皂苷已被多項臨床研究證實具有調節血管生成、保護心血管、興奮腎上腺皮質系統以及增強網狀內皮系統功能，從而可實現改善全身臟器的供血、毛細血管微循環及抗凝作用。這是近年來解釋參麥注射液用于緩解CIPN的作用機制之一[7]。

網絡藥理學是通過融合系統生物學、網絡生物學、分子藥理學等多學科技術構建整合“疾病-表型-基因-藥物”網絡，用于分析藥物在網絡中與特定節點的相互作用關系，進而從系統、整體角度探索藥物與機體相互作用的一門新學科。網絡藥理學可用于揭示中藥復方的科學內涵、發現藥物靶標、指導中藥新藥研發[8]。因此，本文擬通過網絡藥理學方法分析參麥注射液緩解CIPN的作用機制，在現有臨床應用基礎上提供細胞分子層面的參考。

1 方法

1.1 參麥方成分收集及靶點預測 以“紅參”“麥冬”為關鍵詞，借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/index.php)以及中醫藥百科全書(ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)檢索參麥注射液主要組分中的化學成分，并參考相關文獻[9]報道進行補充。

類藥性(druglikeness weight，DL值)是指化合物與已知藥物的相似性。由于常見中藥成分繁多復雜，因此利用類藥性數值，可篩選出成藥可能性較高的目標成分[10]。借助 TCMSP、ETCM數據平臺，篩選出紅參與麥冬中符合DL值≥0.18的化學成分作為目標成分，并收集其潛在的靶點信息。

1.2 CIPN靶點收集篩選 以“chemotherapy-induced peripheral neurotoxicity”“neurotoxicity of chemotherapy”為關鍵詞，在Disgenet(https://www.disgenet.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)以及GeneCards(https://www.genecards.org/)等數據庫中檢索與CIPN相關的基因。

1.3 參麥成分與靶點相互作用網絡 將“1.1”與“1.2”項下得到的參麥成分與CIPN的共同靶點，利用Cytoscape 3.9.1構建化合物-靶點網絡，并對得到的網絡進行拓撲分析。

1.4 蛋白互作網絡(PPI)的構建及核心網絡的篩選 將“1.3”項下的共同靶點上傳至STRING 11.5(https://string-db.org)，設定物種智人(Homo sapiens)，置信度設為“medium confidence=0.4”，獲取蛋白相互作用的關系并保存PPI網絡文件。將網絡文件導入Cytoscape 3.9.1軟件中利用Network Analyzer功能進行拓撲參數分析，獲取度中心性(degree centrality)、介數中心性(betweenness centrality)和緊密度(closeness centrality)的數據，利用以上3個參數的平均數值篩選PPI中的核心靶蛋白[11]，進而得到蛋白互作核心網絡(protein-protein interaction core network，PPICN)。

1.5 核心靶點的GO富集分析與KEGG通路分析 將“1.4”項下的核心靶點導入Metascape數據庫(https://metascape.org/)，輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，設定檢驗標準為P<0.01，進行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選 通過TCMSP、ETCM檢索以及文獻查找，搜集到紅參、麥冬中化合物組分共86個，其中紅參成分34個，麥冬成分52個，如表1所示。

表1 紅參-麥冬有效成分匯總

2.2 參麥注射液-CIPN靶點數據集構建 通過Disgenet、OMIM、GeneCards數據庫搜集到紅參與麥冬活性化合物共334個作用靶點，CIPN相關基因共1 460個。通過在線韋恩圖得出參麥注射液與CIPN共有基因135個(見圖1)。

圖1 參麥-CIPN共同靶點

2.3 化合物-靶點相互作用網絡 利用Cytoscape 3.9.1軟件，得到參麥成分-靶點相互作用網絡(見圖2)。共有143個節點(即38個化合物節點與105個靶點節點)和234條邊。如圖2所示，紅色代表紅參成分，紫色代表麥冬成分，綠色代表靶點，每條邊表示紅參、麥冬成分與靶點之間的相互作用關系。根據網絡的拓撲學性質篩選度值(degree)較大的節點進行分析，這些度值較大節點在整個網絡中起到樞紐的作用，可能是關鍵活性成分。經統計，有26%的化合物的作用靶點≥10個。麥冬有效成分6個，占比60%。度值排名前10位的化合物見表2。

圖2 參麥成分-靶點相互作用網絡

表2 度值排名前10位的成分化合物

2.4 參麥-CIPN蛋白互作核心網絡(PPICN)的構建 將參麥-CIPN靶點數據集中的靶點信息導入STRING數據庫中構建PPI網絡，利用Cytoscape軟件構進行拓撲參數分析后，以“degree”“betweenness”和“closeness”的平均值作為篩選值。上述網絡中degree平均值為19.970 370 370 370 4，betweenness平均值為0.008 340 918 631 570 61，closeness平均值為0.485 526 621 226 082，選取同時滿足三個卡值的節點作為參麥-CIPN-靶點網絡的核心作用蛋白，共23個：GAPDH、IL-1β、PPARG、MMP9、AKT1、IL-6、TNF、PPARA、ABCB1、NR3C1、MAPK3、TP53、CASP3、CYP3A4、JUN、GSTP1、ESR1、HSPA8、DPP4、FOS、CREB1、AR、TRPV1。

將23個核心蛋白導入STRING得到PPICN(圖3)，共包含23個節點，188條邊，平均節點度值為16.3。

圖3 參麥注射液-CIPN蛋白互作核心網絡

2.5 靶點通路分析 將23個核心靶點輸入到Metascape工具中進行GO富集分析(檢驗水準P<0.01，靶點富集數目≥3，富集因子>1.5)。結果顯示GO條目34個，其中細胞組成(CC)相關的條目5個，生物過程(BP)條目相關的20個，分子功能(MF)相關的條目9個。

對GO-CC進行聚類分析(見圖4)，主要涉及有轉錄調節復合物、膜筏、富含ficolin-1的顆粒管腔、膜側、細胞前緣等。

圖4 GO富集分析-細胞成分

對GO-BP進行聚類分析(見圖5)，主要涉及有細胞對脂質的反應、miRNA轉錄調控、對異種刺激的反應、對活性氧的反應、磷酸鹽代謝過程的負調控、對細胞外刺激的反應、對脂多糖的反應、miRNA介導的基因沉默的調節、細胞死亡的正向調節、細胞對激素刺激的反應、激素水平的調節、對腫瘤壞死因子的反應、膠質細胞活化、對糖皮質激素的反應、調節血壓、對酮的反應、對輻射的反應、破骨細胞分化的正向調節、Ⅰ-κB激酶/NF-κB信號的調節、對含嘌呤化合物的反應等。

圖5 GO富集分析-生物過程

對GO-MF進行聚類分析(見圖6)，主要涉及：RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、蛋白結構域特異性結合、R-SMAD結合、蛋白酶結合、DNA結合轉錄抑制活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、細胞因子受體結合、泛素蛋白連接酶結合、蛋白激酶結合、磷脂結合等。

圖6 GO富集分析-分子功能

KEGG通路富集分析得到9條信號通路(見圖7)，主要涉及脂質和動脈粥樣硬化、癌癥途徑、非酒精性脂肪肝、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、前列腺癌、胰島素抵抗、長壽調節通路、甲狀腺癌、抗原加工和呈遞等。

圖7 KEGG信號通路分析

3 討論

CIPN屬于劑量限制性毒性反應，隨著化療療程的推進，藥物劑量持續累積，CIPN的癥狀表現也會隨之進行性加重，甚至造成永久性神經損傷。為保障患者化療后的生活質量以及腫瘤治療的順利進行，急需解決CIPN的防治難題。目前實際臨床用于治療CIPN的方法和藥物較多，但作用效果仍有待研究[12]。參麥注射液以紅參、麥冬為主要原料，經現代制劑加工而成，具有益氣固脫、養陰生津之功效，能加強機體器官抗應激能力。參麥注射液與化療藥物合用時，有一定的減毒作用。姜超等[13]研究90例接受含奧沙利鉑方案化療的結直腸癌患者，在化療開始同時分別給予參麥注射液靜脈或口服甲鈷胺片比較兩組神經毒性反應發生情況及神經傳導速度。結果顯示與口服甲鈷胺片比較，對于接受含奧沙利鉑輔助化療方案的結直腸癌患者，靜脈注射參麥注射液更能有效減少周圍神經毒性反應。張潔等[14]將125例應用含紫杉醇化療方案化療的癌癥患者隨機分為2組，其中試驗組(64例)化療前1 d開始加用參麥注射液。結果試驗組神經毒性發生率為26.6%(17/64)，對照組為57.4%(35/61)；周圍神經功能測定，試驗組腓神經運動神經傳導速度(MNCV)及感覺神經傳導速度(SNCV)均優于對照組，表明參麥注射液對含紫杉醇化療方案所致的周圍神經毒性具有明顯的防治作用。

本研究通過網絡藥理學的分析方法，得到參麥注射液對于改善CIPN癥狀相關的有效成分，包括腺苷、β-谷固醇、齊墩果酸、豆甾醇、花生酸、麥冬素A、刺五加苷A、麥冬素C、正二十四烷、人參皂苷Rh2等。基于從數據庫獲得的作用靶點和疾病靶點，對兩個數據集進行映射，得到“參麥-CIPN”數據集，對PPICN中的23個核心靶點用Metascape進行GO富集分析和KEGG信號通路分析，結果表明參麥注射液改善CIPN的生物過程主要涉及有細胞對脂質的反應、miRNA轉錄調控、對異種刺激的反應、對活性氧的反應、磷酸鹽代謝過程的負調控、對細胞外刺激的反應、對脂多糖的反應、miRNA介導的基因沉默的調節、細胞死亡的正向調節、細胞對激素刺激的反應、激素水平的調節、對腫瘤壞死因子的反應、膠質細胞活化、對糖皮質激素的反應、調節血壓、對酮的反應、對輻射的反應、破骨細胞分化的正向調節、Ⅰ-κB激酶/NF-κB信號的調節、對含嘌呤化合物的反應等。所作用的信號通路主要有脂質和動脈粥樣硬化、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、胰島素抵抗、長壽調節通路抗原加工和呈遞等。

綜上，本文基于網絡藥理學理念與方法，應用多種生物信息數據庫和分析工具對參麥注射液的有效組分、作用靶點以及對CIPN作用機制進行了探討。參麥注射液中對CIPN關鍵活性成分源自麥冬的組分占比60%，相比紅參，麥冬可能起到更重要的作用；GO富集分析與KEGG通路分析共獲得34個相關條目及9條相關信號通路，即參麥注射液通過多靶點與多通路的協同作用緩解CIPN。目前對于參麥注射液在CIPN領域應用的研究較多，但通過網絡藥理學方法探討其作用機制并不多見。同時由于本研究的結論仍需要進一步分子對接等相關驗證，因此本文可為后續研究提供信息和依據。