廣西北部灣地區(qū)鼻咽癌患者臨床特點和P53、EGFR表達情況分析

寧燕華 ，施國元 ，陳世好 ，梁丹 ，賴朝培

(廣西欽州市第一人民醫(yī)院 a.病理科，b.耳鼻喉科，廣西欽州 535000)

鼻咽癌是臨床上較為常見的一種EB病毒相關(guān)性惡性腫瘤，我國廣西是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)之一，亦是少數(shù)民族聚集地，存在人群遺傳背景的特點。鼻咽癌的發(fā)病部位是鼻咽黏膜上皮，上可侵入顱底，下可引發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，盡管醫(yī)療技術(shù)與日俱進，大部分患者均可獲得較佳的臨床治療效果，但仍有部分患者預(yù)后不良。鼻咽癌的準(zhǔn)確診斷對臨床治療方案的制定具有極其重要的意義，亦是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。然而，由于鼻咽癌具有較強的隱匿性，大部分患者一經(jīng)確診便已是中晚期，預(yù)后往往較差。故此，如何有效診治鼻咽癌顯得尤為重要，亦是目前臨床研究的熱點。隨著近年來相關(guān)研究的逐漸深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，P53及表皮生長因子受體(EGFR)等基因于多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均起著至關(guān)重要的作用。由此，本文通過研究P53及EGFR表達與廣西北部灣地區(qū)鼻咽癌患者臨床特點的相關(guān)性，旨在為臨床鼻咽癌的診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

納入廣西北部灣地區(qū)醫(yī)院從2014年2月—2016年12月收治的鼻咽癌患者60例進行研究。其中男性患者28例，女性患者32例；年齡31～78歲，平均(57.22±10.24)歲；體重指數(shù)(BMI)值18～27 kg/m，平均BMI值(23.84±1.35)kg/m；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期25例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者居住于廣西北部灣地區(qū)時間在1年以上；(2)年齡均在18周歲以上；(3)入院前尚未接受手術(shù)、化療、放療以及生物治療等相關(guān)抗腫瘤治療；(4)無臨床病歷資料缺失；(5)所有受試者均經(jīng)病理檢查確診為低分化鱗狀細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)伴有嚴(yán)重感染性疾病、免疫性疾病以及血液系統(tǒng)疾病者；(3)心、肝、腎等重要臟器發(fā)生損傷者；(4)意識障礙或伴有精神疾病者；(5)研究期間因故退出或失訪者。納入對象均在知情同意書上簽字，并獲批于醫(yī)院倫理委員會。

采集所有受試者接受治療前的鼻咽癌組織以及癌旁正常組織，采用4%的福爾馬林實施固定處理，并以乙醇完成脫水。隨后將標(biāo)本進行石蠟包埋，通過石蠟切片機制成厚度為4 μm的連續(xù)切片。采用二甲苯脫蠟以及酒精脫水處理切片標(biāo)本，同時浸泡于PBS液中5 min。予以高壓抗原修復(fù)3次后將其放置在室溫下自然冷卻，然后予以3%過氧化氫孵育，達到滅活內(nèi)源性生物素以及過氧化物酶活性的目的。予以PBS液重復(fù)沖洗3次，2 min/次，沖洗結(jié)束后添加正常山羊血清封閉，放置在室溫內(nèi)繼續(xù)孵育10 min。分別加入鼠抗人P53單克隆抗體以及兔抗人EGFR單克隆抗體，并置于4 ℃條件下冷藏過夜。待恢復(fù)常溫后繼續(xù)滴加二抗于室溫條件下孵育，在此予以PBS液重復(fù)沖洗3次，5 min/次。實施DAB顯色，予以自來水重復(fù)沖洗3次，2 min/次，蘇木精復(fù)染，無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，予以中性樹膠封片晾干觀察。

P53及EGFR均以細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性，前者主要定位于細(xì)胞核，后者定位于細(xì)胞漿與細(xì)胞膜。判定標(biāo)準(zhǔn)主要是根據(jù)染色結(jié)果評分與陽性細(xì)胞占比評分進行最后評分，其中染色評分如下：無色即為0分；黃色即為1分；棕黃色即為2分；棕褐色即為3分。陽性細(xì)胞占比評分如下：無陽性細(xì)胞即為0分；陽性細(xì)胞占比低于10%即為1分；陽性細(xì)胞占比在11%～50%之間即為2分；陽性細(xì)胞占比在51%～80%之間即為3分；陽性細(xì)胞超過80%即為4分。以染色評分與陽性細(xì)胞占比評分的乘積作為最后結(jié)果，若乘積<6分即為陰性，≥6分即為陽性。

(1)比較鼻咽癌組織及癌旁正常組織中P53及EGFR蛋白表達情況；(2)分析鼻咽癌組織中P53及EGFR陽性表達與鼻咽癌患者的臨床特點關(guān)系；(3)對所有患者進行為期3年的隨訪觀察，比較不同生存狀況患者P53及EGFR蛋白表達情況；(4)分析鼻咽癌患者P53及EGFR蛋白表達的相關(guān)性。

以SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以[(%)] 表示，進行連續(xù)性校正χ檢驗以及McNemar χ檢驗。采用Spearman相關(guān)性分析鼻咽癌患者P53及EGFR蛋白表達的相關(guān)性。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié) 果

鼻咽癌組織中P53蛋白陽性率低于癌旁正常組織，而EGFR蛋白陽性率高于癌旁正常組織(均<0.001)。見表1。

表1 不同組織中P53及EGFR蛋白表達情況對比[n(%)]

年齡≥60歲、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌患者的P53蛋白陽性率均低于年齡<60歲、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者；而年齡≥60歲、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者的EGFR蛋白陽性率均高于年齡<60歲、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(均<0.05)。見表2、表3。

表2 P53蛋白表達情況與鼻咽癌患者的臨床特點關(guān)系分析[n(%)]

表3 EGFR蛋白表達情況與鼻咽癌患者的臨床特點關(guān)系分析[n(%)]

鼻咽癌死亡組患者的P53蛋白陽性率低于存活組，而EGFR蛋白陽性率高于存活組(均<0.05)。見表4。

表4 鼻咽癌患者3年生存狀況和P53、EGFR蛋白表達情況的關(guān)系分析[n(%)]

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者P53及EGFR蛋白表達呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(=-0.622，<0.001)。

3 討 論

隨著近年來人們生活方式的不斷改變以及生活環(huán)境的日益惡化，鼻咽癌的發(fā)病率正呈逐年升高趨勢，由于鼻咽癌細(xì)胞增殖迅速且具有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險，已成為嚴(yán)重威脅我國居民生命健康安全的重大疾病之一。放療是目前臨床廣泛用以治療鼻咽癌的有效手段之一，但鼻咽癌患者預(yù)后個體差異明顯，即使臨床以及病例特點基本相同的鼻咽癌患者，其生存狀況亦會存在明顯差異。近年來，病理學(xué)家致力于研究鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展分子機制，發(fā)現(xiàn)EGFR以及P53作為常見的腫瘤相關(guān)基因，可能和鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本文研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中P53蛋白陽性率低于癌旁正常組織，而EGFR蛋白陽性率高于癌旁正常組織。這和歐陽清等人的研究報道相符：其在報道中指出，P53蛋白在鼻咽癌組織中陽性表達率較低，而EGFR蛋白陽性表達率較高。因此結(jié)合本研究的結(jié)果也充分提示了在臨床工作中通過對上述兩項蛋白表達情況進行檢測，可能有助于鼻咽癌的臨床診斷。分析原因，P53屬于抑癌基因之一，其抑癌作用機制主要是通過阻止G1/G0期，促使細(xì)胞分裂無法進入DNA合成期，進一步對細(xì)胞的增生起到抑制作用，繼而激活轉(zhuǎn)錄抑制細(xì)胞增生的基因。一旦P53基因表達下降，會導(dǎo)致其調(diào)控細(xì)胞周期以及監(jiān)視細(xì)胞生長的作用喪失，繼而引發(fā)染色體畸變或/和基因突變，最終引發(fā)腫瘤。EGFR主要是由EGFR基因所編碼的一種跨膜蛋白受體，可通過和表皮生長因子結(jié)合，繼而磷酸化胞內(nèi)酪氨酸激酶，促進一系列信號傳導(dǎo)通路的激活，繼而促進細(xì)胞增殖、分化以及轉(zhuǎn)移，發(fā)揮促癌作用。此外，本研究還提示了P53、EGFR蛋白表達和鼻咽癌患者的年齡、病情嚴(yán)重程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但和患者性別、BMI無關(guān)。究其原因，正常細(xì)胞在遭受外界致癌作用時會引起P53功能的喪失，從而促使其對細(xì)胞周期正常調(diào)控作用喪失，引起細(xì)胞的無限增生，繼而促進鼻咽癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。EGFR則可通過和多種細(xì)胞因子相結(jié)合，繼而提高血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)腫瘤血管的生成，從而達到促進腫瘤生長的作用。此外，P53、EGFR可共同作用在鼻咽黏膜上皮，繼而影響鼻咽癌的進展、轉(zhuǎn)移過程。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)隨著P53蛋白表達的下降以及EGFR蛋白的升高，鼻咽癌患者預(yù)后越差。其中主要原因可能是P53蛋白表達的下降以及EGFR蛋白的升高共同促進了鼻咽癌的進展、侵襲以及轉(zhuǎn)移。這也充分說明了P53和EGFR的變化可以更好地幫助臨床判斷患者的病情狀況及癌灶累及情況，并及時調(diào)整相應(yīng)的治療方案，從而有助于后續(xù)治療的進行。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者P53及EGFR蛋白表達呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這提示了上述兩項蛋白可能在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著相互作用，繼而共同介導(dǎo)上述過程。需要指出的是性別也可能與P53和EGFR蛋白的陽性表達有關(guān)。但本文未發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)論，原因考慮與本次研究的樣本量相對較少有關(guān)，今后可擴大樣本量或者邀請其他各級醫(yī)療機構(gòu)進行更加科學(xué)的協(xié)同性研究分析。同時，為了更加科學(xué)地治療鼻咽癌，臨床可組建多學(xué)科聯(lián)合治療(MDT)團隊開展綜合診治，視情況綜合放療科、耳鼻喉科、腫瘤科、影像科和病理科以及醫(yī)務(wù)科等科室集思廣益，盡可能以最佳的治療為患者的預(yù)后提供堅實的保障。另外，P53聯(lián)合EGFR蛋白診斷鼻咽癌的效能較高，考慮原因可能和兩項蛋白聯(lián)合檢測具有一定的協(xié)同互補作用有關(guān)。

綜上所述，P53在廣西北部灣地區(qū)鼻咽癌患者中存在明顯低表達，而EGFR存在明顯高表達，臨床工作中針對疑似鼻咽癌患者，可通過聯(lián)合檢測上述兩項蛋白表達，繼而為鼻咽癌的診斷提供參考依據(jù)，有助于治療方案的制定，從而達到改善患者預(yù)后的目的。