玉米S1Fa-like 轉錄因子基因家族的鑒定與表達分析

趙東波，高建勝，郭建軍，李擁軍，薛 鑫，郭良海

（1.德州市農業科學研究院,山東 德州 253015;2.德州學院,山東 德州 253023）

轉錄因子通過激活或者抑制相關基因的表達，提高植物的非生物脅迫耐受性。轉錄因子S1Fa 最早從菠菜中發現，是含有70 個氨基酸的小肽，負調控rps1 表達，其保守結構域包含核定位信號和特定的DNA 結合位點，在雙子葉植物和單子葉植物之間高度保守，主要在根和黃化幼苗等組織中表達。S1Fa-like TFs（transcription factors）的數量在不同的植物種類中差異很大。大多數植物不超過5 個S1Fa-like 家族成員；然而花生基因組中含有126 個S1Fa-like 轉錄因子，且被鑒定為膜結合型轉錄因子。越來越多的研究發現，S1Fa-lik TFs 響應植物的非生物脅迫，如甘藍型油菜（Brassica napus）中S1Fa-like響應鹽脅迫刺激；棉花（Gossypium hirsutum）中S1FalikeTFs 大多數成員受非生物脅迫刺激表達量下調；楊樹（Populus trichocarpa）中PtS1Fa1 和PtS1Fa2 的表達受到干旱和鹽脅迫的抑制，且響應ABA、MeJA、SA等激素刺激，其中PtS1Fa2 通過增加抗氧化劑活性，減少活性氧（ROS）積累，進而增強楊樹的耐旱性。

植物在生長發育過程中必須應對非生物脅迫，如土壤鹽度、干旱和極端溫度。然而，關于玉米S1Fa-like TFs 生物信息學、組織表達及脅迫調控表達模式的研究未見報道。本研究采用生物信息學方法，分析玉米S1Fa-like TFs 基因結構、染色體定位、蛋白理化性質、進化關系及組織表達和脅迫表達模式，通過qRT-PCR 技術檢測玉米S1Fa-like TFs 受熱脅迫時的表達量，為深入解析玉米S1Fa-like TFs在響應非生物脅迫應答中的生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 基因家族的鑒定、蛋白質理化性質及亞細胞定位分析

從PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）查詢S1Fa-like TFs 成員，并利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）對得到的蛋白序列進行保守結構域驗證。利用Expasy 中的ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/)工具獲取蛋白質理化性質信息，Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進行蛋白亞細胞定位分析。

1.2 家族蛋白進化和二級結構預測分析

通過PlantTFDB 獲取單子葉植物（大麥、玉米、秈稻、粳稻、高粱、小麥、烏拉爾小麥）和雙子葉植物（獼猴桃、擬南芥、油菜、大豆、棉花、楊樹、菠菜）共14 種作物的S1Fa-like TFs 蛋白序列，利用MEGA7.0軟件中最大似然法（Maximum Likelihood，bootstrap=1000）構建系統發育樹。利用在線網站SOMPA（http://www.prabi.fr/）預測蛋白二級結構。

1.3 保守基序、基因結構及啟動子分析

利用在線工具MEME（http://memesuite.org/）對家族蛋白進行motif 分析，預測基因家族成員的保守結 構 域。使 用PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線預測ZmS1Fas啟動子區域(ATG 上游2 000 bp)順式調控元件。

1.4 基因組織表達和誘導表達模式分析

從MaizeGDB qTeller 數據庫下載正常組織部位的表達數據（登錄號PMC5808982），NCBI 數據庫下載受干旱脅迫根部位轉錄組數據（登錄號SRP052697）和不同玉米材料苗期受溫度脅迫地上部位轉錄組數據（登錄號SRP106663），利用TBtools軟件中HeatMap 進行可視化處理。

1.5 qRT-PCR 檢測基因家族成員熱脅迫表達量

玉米自交系B73 和Oh43 材料，在16/8 h 光照培養室長日照條件下培養至3 葉期（14 d）。玉米苗被置于42 ℃培養箱中處理4 h，對照則正常條件培養，每個樣本處理6 株幼苗。收集幼苗地上部分，液氮中研磨，提取RNA，反轉錄之后以ZmActin1 為內參，檢測ZmS1Fas 脅迫處理前后的相對表達量，并采用GraphPad Prism 軟件作圖。所用引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物

2 結果與分析

2.1 ZmS1Fas 的鑒定、理化性質、亞細胞定位分析及蛋白二級結構預測

從PlantTFDB 獲取S1Fa-like 家族成員蛋白序列，經Pfam 檢驗，結果顯示（圖1-C），家族成員均含有S1FA 或S1FA superfamily 保守結構域。根據染色體位置命名為ZmS1Fa1、ZmS1Fa2（圖2），ZmS1Fa1位于2 號染色體、ZmS1Fa2 位于10 號染色體。ZmS1Fas 共編碼5 個蛋白（4 種不同蛋白，表2），蛋白長度為56～80 個氨基酸；分子量在6 310.77～8 867.10 Da 之間；等電點在9.82～10.25 之間，均為堿性蛋白；不穩定系數在33.18～37.49 之間，均小于40，屬于穩定蛋白；脂肪指數在101.00～105.27 之間，具有良好的熱穩定性；親水性系數在-0.049～0.070 之間，表明ZmS1Fas 家族成員親水性氨基酸和疏水性氨基酸基本持平；亞細胞定位結果顯示，ZmS1Fas 家族成員均定位在細胞核內。蛋白二級結構分析結果表明（表3），其α-螺旋、延長鏈、β-轉角、無規則卷曲等蛋白質二級結構在ZmS1Fas 基因家族成員中均有分布且占比差別不大。

圖1 ZmS1Fas 系統進化樹（A）、保守基序（B）、保守結構域（C）和基因結構（D）

圖2 ZmS1Fas 基因染色體定位

表2 ZmS1Fas 蛋白理化性質

表3 ZmS1Fas 蛋白二級結構

2.2 ZmS1Fas 系統進化、保守基序及基因結構分析

將單子葉和雙子葉植物共14 種作物的51 個S1Fa-like 蛋白氨基酸序列進行多重比對，并構建系統進化樹（圖3）。結果表明，單子葉植物與雙子葉植物被分開，說明S1Fa-like 家族快速擴增可能發生在單子葉植物與雙子葉植物分化之前。ZmS1Fas 和高粱S1Fa-like 家族成員具有較高的親緣關系。對ZmS1Fas 蛋白進行motif 分析，結果（圖1-B）顯示：ZmS1Fas 保守基序較簡單，均含有motif1（含50 個氨基酸），占ZmS1Fas 蛋白長度的62.5%～89.3%，推測其為ZmS1Fas 基因家族成員的核心功能區域。ZmS1Fas 的基因結構相對保守（圖1-D），均含有1～2 段外顯子，0～1 段內含子，且均具有5'UTR 和3'UTR。

圖3 S1Fa-like 基因家族系統進化樹

2.3 ZmS1Fas 順式作用元件分析

檢索ZmS1Fas 啟動子上已知的激素和脅迫相關的響應元件，結果顯示（圖4），ZmS1Fas 啟動子區域含有豐富的激素（脫落酸、水楊酸、乙烯、茉莉酸、茉莉酸甲酯、生長素、赤霉素等）和脅迫（如高溫、低溫、干旱、厭氧、損傷等）相關的響應元件。尤其脫落酸響應元件，ZmS1Fas 成員平均含有13.2 個；其次是茉莉酸和茉莉酸甲酯響應元件，平均含有8.6 個。干旱響應元件也很豐富，在ZmS1Fa1.1、ZmS1Fa1.2和ZmS1Fa2.3 的啟動子區均含有10 個以上。

圖4 ZmS1Fas 啟動子區域激素和脅迫相關順式作用元件的分布

2.4 ZmS1Fas 基因組織表達和脅迫表達分析

由圖5 可知，正常條件下，除B73 成熟花粉（B73 Mature Pollen），各組織均有ZmS1Fas 基因表達，且多數組織中ZmS1Fa2 的表達量均比ZmS1Fa1的表達量高。授粉12 d 的胚乳（Endosperm 12 DAP）中ZmS1Fa 基因的表達量均高于其他組織部位中的表達量，B73 成熟花粉中表達量均低于其他部位的表達量。ZmS1Fa2 在根皮層、授粉27 d 的果皮、6～7節間、花絲等部位表達量也較高。

圖5 正常條件下ZmS1Fas 表達模式分析

由組織表達模式可知，在根部位ZmS1Fas 表達量較高，選取根部位干旱脅迫表達數據，結果顯示（圖6），受干旱脅迫，其ZmS1Fas 轉錄水平并未達到顯著上調或下調，推測ZmS1Fas 轉錄因子家族可能在蛋白質水平響應干旱脅迫。

圖6 受干旱脅迫ZmS1Fas 在根部位的表達

由圖7 可知，自交系Oh43 和雜交種Oh43×B73受高溫脅迫，ZmS1Fas 均顯著上調表達；自交系PH207 受低溫脅迫，ZmS1Fas 均顯著下調表達。不同玉米材料中，ZmS1Fas 響應溫度脅迫模式不同，為選育耐高溫或低溫的玉米種質提供了理論支持，為玉米遺傳改良提供潛在的基因資源。

圖7 不同玉米材料受溫度脅迫ZmS1Fas 的表達

2.5 ZmS1Fas 熱調控表達模式分析

為進一步明確ZmS1Fas 基因熱脅迫表達模式，以ZmActin1 為內參，檢測自交系B73 和Oh43 熱脅迫表達量。設置正常條件下基因的相對表達量（CK）為1，結果（圖8）表明，ZmS1Fa1 和ZmS1Fa2 在B73中均受熱脅迫輕微下調表達；而在Oh43 中受熱脅迫顯著上調表達，受熱脅迫處理材料中ZmS1Fa1 和ZmS1Fa2 表達量約是正常生長材料表達量的2 倍。與生物信息學預測結果基本一致，不同材料中ZmS1Fas 基因響應熱脅迫模式不一致。筆者推測ZmS1Fas 在玉米響應非生物脅迫方面具有潛在的功能。

圖8 熱脅迫條件下ZmS1Fas 的相對表達量

3 結論與討論

目前，玉米中許多逆境脅迫相關基因家族已經被鑒定和分析，如VOZ、GATA等基因，而關于S1Fa 基因的研究少之又少。本研究在玉米中共鑒定到2 個ZmS1Fas 基因，均含有S1FA 或S1FA superfamily 保守結構域，共編碼5 個蛋白，長度為56～80 個氨基酸；分子量在6 310.77～8 867.10 Da 之間；均為堿性蛋白；不穩定系數均小于40，屬于穩定蛋白，具有良好的熱穩定性；α-螺旋、延長鏈、β-轉角、無規則卷曲等蛋白質二級結構占比差別不大。ZmS1Fas 蛋白均定位在細胞核內。將大麥、玉米、秈稻、粳稻、高粱、小麥、烏拉爾小麥、獼猴桃、擬南芥、油菜、大豆、棉花、楊樹、菠菜等14 種作物的51 個S1Fa-like 蛋白氨基酸序列進行多重比對，發現單子葉植物和雙子葉植物的S1Fa-like 蛋白具有高度保守性。ZmS1Fas 保守序列較簡單，motif1 是ZmS1Fas基因家族成員的核心功能區域。ZmS1Fas 均含有1～2 段外顯子，0～1 段內含子，且均具有5'UTR 和3'UTR。ZmS1Fas 啟動子區域含有豐富的與激素響應和非生物脅迫相關的調控元件。筆者推測S1Fa 轉錄因子作用元件可能參與植物逆境脅迫的響應，有利于植株的生長發育。

在正常生長條件下，除B73 成熟花粉(B73 Mature Pollen)，各組織均有ZmS1Fas 基因表達，且多數組織中ZmS1Fa2 的表達量均比ZmS1Fa1 的表達量高。受到干旱脅迫時，ZmS1Fas 在轉錄水平與正常生長材料中表達量差異不顯著。自交系Oh43 和雜交種Oh43×B73 受高溫脅迫，ZmS1Fas 均顯著上調表達；自交系PH207 受低溫脅迫，ZmS1Fas 均顯著下調表達。qRT-PCR 檢測了熱脅迫時ZmS1Fas 基因的表達量，結果表明，ZmS1Fa1 和ZmS1Fa2 在B73中均受熱脅迫輕微下調表達；而在Oh43 中受熱脅迫顯著上調表達，與生物信息學預測的“ 不同玉米材料中ZmS1Fas 響應溫度脅迫模式不同” 結果一致。這表明S1Fa 基因在復制后有可能發生功能分化，從而導致S1Fa 基因的功能多樣性，促進了植物的生長調控和對自然環境的適應，為進一步解析ZmS1Fas在響應非生物脅迫應答中的生物學功能奠定基礎。