南江黃羊體表膿腫病原菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

譚玉祥，何興隆，魏 甬

（1.巴中市南江黃羊科學(xué)研究所，四川 南江 635600；2.四川省南江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 南江 635600；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

體表膿腫病是南江黃羊養(yǎng)殖生產(chǎn)中的常見(jiàn)病，以軀干體表出現(xiàn)局部膿腫病灶為特征，季節(jié)性不明顯，各個(gè)日齡階段均可發(fā)生，引起局灶性紅腫熱痛、個(gè)體生長(zhǎng)遲滯等。通常在膿腫出現(xiàn)波動(dòng)感后，采取外科手術(shù)式切口、排膿、沖洗、消毒、抗菌藥物灌注，能獲得一定的療效。若治療不當(dāng)或治療不及時(shí)，病灶可逐漸擴(kuò)大、化膿甚至出現(xiàn)全身敗血癥，從而給南江黃羊防疫管理、產(chǎn)品安全等方面帶來(lái)較大的損失。本文就該病致病菌的分離鑒定及抗菌藥物篩選開(kāi)展探討。

1 材料與方法

1.1 病料 從南江縣部分規(guī)模羊場(chǎng)患病羊的頸部、胸部、腹部及后軀部等體表膿腫病灶處經(jīng)局部剪毛、碘酒消毒及酒精脫碘消毒后，用滅菌注射器具穿刺無(wú)菌采集膿液樣品。

1.2 主要試劑 綿羊血瓊脂平板，MH 瓊脂培養(yǎng)基，普通肉湯培養(yǎng)基，藥敏紙片，細(xì)菌DNA提取試劑盒，革蘭氏染色試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離及形態(tài)觀察 用無(wú)菌接種環(huán)采取病羊膿液樣品，無(wú)菌條件下劃線接種于綿羊血瓊脂平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再對(duì)單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。參照革蘭氏染色試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.2 細(xì)菌16S rDNA 鑒定 將純化培養(yǎng)的細(xì)菌無(wú)菌接種至普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)18 h，用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。采用細(xì)菌通用16S rDNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增條件參照張玲等［1］的試驗(yàn)報(bào)告。PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，根據(jù)同源性高低確定細(xì)菌種屬。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 參照向益等［2］的方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（WST 125-1999）及美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)與指南進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及形態(tài)觀察 從5 只病羊不同部位的膿腫液中共分離出4 株細(xì)菌，將其編號(hào)為①～④號(hào)，具體情況見(jiàn)表1。①～④號(hào)分離菌接種至血平板后，均出現(xiàn)透明的β溶血環(huán)。①號(hào)為革蘭氏陰性菌，呈細(xì)桿狀，單個(gè)散在或成對(duì)存在；②③號(hào)為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈球桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)散在存在；④號(hào)為革蘭氏陰性菌，呈球桿狀。

表1 細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果

2.2 細(xì)菌16S rDNA 鑒定 用PCR 擴(kuò)增4 株細(xì)菌的16S rDNA，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)：①號(hào)為短小芽孢桿菌；②③號(hào)均為假結(jié)核棒狀桿菌；④號(hào)為支氣管敗血波氏桿菌。

2.3 藥敏試驗(yàn) ①號(hào)短小芽孢桿菌對(duì)頭孢吡肟和頭孢西丁有耐藥性，對(duì)其余10種藥物敏感或中度敏感，詳見(jiàn)表2。②號(hào)假結(jié)核棒狀桿菌對(duì)12 種藥物敏感或中度敏感，詳見(jiàn)表3。③號(hào)假結(jié)核棒狀桿菌對(duì)頭孢西丁和鏈霉素存在耐藥性，對(duì)其余10 種藥物敏感或中度敏感，詳見(jiàn)表4。④號(hào)支氣管敗血波氏桿菌對(duì)頭孢西丁耐藥，對(duì)其余11種藥物敏感或中度敏感，詳見(jiàn)表5。

表2 ①號(hào)短小芽孢桿菌的藥敏試驗(yàn) mm

表3 ②號(hào)假結(jié)核棒狀桿菌的藥敏試驗(yàn) mm

表4 ③號(hào)假結(jié)核棒狀桿菌的藥敏試驗(yàn) mm

表5 ④號(hào)支氣管敗血波氏桿菌的藥敏試驗(yàn) mm

3 討論

本研究從病羊的膿腫液病料中分離培養(yǎng)出4株細(xì)菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)及16S rDNA鑒定為短小芽孢桿菌、假結(jié)核棒狀桿菌、假結(jié)核棒狀桿菌和支氣管敗血波氏桿菌，這4株細(xì)菌都具有溶血性。

短小芽孢桿菌通常作為一種有益菌應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域［3］，由于其具有溶血性，目前在人類醫(yī)學(xué)上正研究用其治療血栓。在植物方面，由于其具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，目前正研究將其作為一種生物拮抗劑用于生物防治。短小芽孢桿菌還可用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)、廢水處理和環(huán)境污染物的降解。然而也有很多報(bào)道指出短小芽孢桿菌能夠引起人類疾病，如抑制精子活動(dòng)、破壞精子細(xì)胞膜通透性屏障、破壞線粒體以及抑制胞漿NAD 還原反應(yīng)等［4］。本研究從病羊的膿腫液中分離出短小芽孢桿菌，提示該菌可能對(duì)羊具有一定的致病性，但是關(guān)于該菌對(duì)山羊的具體致病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

假結(jié)核棒狀桿菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，具有溶血性。該菌侵入宿主后，隨血液傳播，在淋巴間隙或組織間形成化膿性病灶。目前，有較多的關(guān)于該菌引起羊患膿腫病的報(bào)道，并且放牧羊的發(fā)病率很高，通常引起山羊體表淋巴結(jié)腫脹化膿，且能導(dǎo)致體內(nèi)淋巴結(jié)或內(nèi)臟膿腫［5］。隨著抗生素的濫用，該菌的耐藥性逐漸升高，所以在用藥前進(jìn)行藥敏試驗(yàn)可有效縮短治療時(shí)間，節(jié)約成本。李基棕等［6］從山羊肩前淋巴結(jié)膿腫樣本中分離到一株假結(jié)核棒狀桿菌，發(fā)現(xiàn)其對(duì)鏈霉素和環(huán)丙沙星耐藥，這與本研究結(jié)果存在差異，可能與菌株來(lái)源不同有關(guān)。

目前，支氣管敗血波氏桿菌已從患病的豬［7］、小熊貓［8］、貓［9］、林麝［10］和兔［11］身上被分離出來(lái)。支氣管敗血波氏桿菌主要引起呼吸道疾病，引起動(dòng)物鼻炎、支氣管肺炎或膿皰型肺炎等。本研究從病羊的膿腫病料中分離出了一株支氣管敗血波氏桿菌，可見(jiàn)該菌也會(huì)引起動(dòng)物其他組織感染。研究發(fā)現(xiàn)支氣管敗血波氏桿菌可從家畜傳染給人類，并對(duì)免疫功能低下的人群可能造成嚴(yán)重感染，所以該菌具有一定的公共衛(wèi)生學(xué)意義［12］。從不同動(dòng)物身上分離的支氣管敗血波氏桿菌菌株存在不同程度的耐藥性，但總的來(lái)說(shuō)，所有支氣管敗血波氏桿菌分離株均對(duì)頭孢類藥物耐藥，所以臨床上應(yīng)選擇性地用藥治療。

4 結(jié)論

短小芽孢桿菌是否能引起山羊致病仍需進(jìn)一步研究，假結(jié)核棒狀桿菌和支氣管敗血波氏桿菌可能是引起此次南江黃羊患皮膚膿腫病的病原。此外，在養(yǎng)羊生產(chǎn)中可交叉使用克拉霉素、環(huán)丙沙星、青霉素和四環(huán)素等藥物，用于治療由短小芽孢桿菌、假結(jié)核棒狀桿菌和支氣管敗血波氏桿菌引起的感染。