ASFV核酸防污染恒溫隔絕式熒光PCR檢測(cè)方法的建立

陳雪蓉，徐 林，王遠(yuǎn)微，湯 承，岳 華*

（1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 康定 626000）

非洲豬瘟（ASF）是非洲豬瘟病毒（ASFV）感染豬引發(fā)的一種急性、熱性、高度接觸性、致豬高死亡率的傳染性疾病，典型臨床癥狀是皮膚泛紅、高熱、腹瀉和出血［1-2］。由于ASF 的臨床癥狀很難與古典豬瘟（CSF）和豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）區(qū)分開(kāi)，使得ASF 難以準(zhǔn)確診斷，還需通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來(lái)確診。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA 復(fù)制，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于ASFV檢測(cè)中。但由于PCR較高的靈敏度，使其易受污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，進(jìn)而嚴(yán)重影響PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)方法的靈敏度越來(lái)越高，造成污染的風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越高，造成PCR污染的主要污染源是擴(kuò)增產(chǎn)物和陽(yáng)性對(duì)照物。由于拷貝數(shù)量極大，在PCR擴(kuò)增時(shí)的開(kāi)蓋、搖動(dòng)、吸樣過(guò)程中與空氣接觸形成氣溶膠體，污染空氣、試劑、移液器以及操作人員的手套衣物，使陰性對(duì)照反復(fù)出現(xiàn)污染，造成檢測(cè)無(wú)法正常進(jìn)行。

1 材料

1.1 臨床樣本 豬細(xì)小病毒（PPV）WH-1 株、豬瘟病毒（CSFV）兔化弱毒株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）GDr 株、豬源偽狂犬病毒（PRV）Bartha-k61 株、豬源乙腦病毒（JEV）SA14-14-2株，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬流行性腹瀉病毒（PEDV）分離株swun620、非洲豬瘟病毒（ASFV）核酸，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，用于特異性評(píng)價(jià)。

51 份ASFV 陽(yáng)性樣本及49 份ASFV 陰性樣本的核酸均由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室（四川省ASF 定點(diǎn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室）提供，用于檢測(cè)方法的比較。

1.2 主要試劑 pMD19-T 克隆載體，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，DL500 DNA Marker，Premix Ex TaqTM（Probe qPCR Mix.with UNG），Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，PetNAD核酸萃取試劑盒。

1.3 主要儀器 移液器，核酸蛋白分析儀，電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)，熒光定量PCR 儀，小型離心機(jī)，POCKIT Micro Plus核酸八通道分析儀。

2 方法

2.1 引物、探針的合成 基于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第172 號(hào)推薦的熒光定量PCR 方法的引物和探針能滿(mǎn)足iiPCR 方法對(duì)引物和探針的要求，所以本研究采用該方法的引物和探針，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為63 bp，引物序列為F：5′-CCTCGGCGAGCGCTT TATCAC-3′，R：5′-GGAAACTCATTCACCAAATC CTT-3′；探針序列為5′-FAM-CGATGCAAGCTTT AT-MGB-3′。引物和探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

2.2 樣本處理

2.2.1 豬組織 對(duì)每種組織分別取樣和處理，取不少于2.0 g 組織，研磨后用5 倍體積滅菌PBS 懸浮，70 ℃滅活30 min，4 ℃下離心10 min，取上清液進(jìn)行核酸提取。

2.2.2 豬全血 直接取相應(yīng)量的全血進(jìn)行核酸提取。

2.3 核酸提取 用于特異性檢驗(yàn)的毒株均采用酚-氯仿-異戊醇法和Trizol 法提取DNA 和RNA。DNA 于－20 ℃保存?zhèn)溆茫琑NA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 ASFV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 采用前述引物以ASFV 陽(yáng)性DNA 為模板進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶用Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒回收并連接到pMD19-T載體上，隨后轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒作為本研究的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度（μg/mL），按照下述公式換算成拷貝/μL：

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品濃度（拷貝/μL）＝陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品濃度×10-9×6.02×1023/（660×質(zhì)粒總長(zhǎng)度）

2.5 反應(yīng)體系的優(yōu)化 參考沈思思［3］的研究，采用50 μL 反應(yīng)體系，對(duì)體系中的上下游引物濃度10 μmol/μL（0.5～5 μL）、熒光探針濃度10 μmol/μL（0.05～0.5 μL）、含UNG的Taq預(yù)混酶5 U/μL（22～28 μL）進(jìn)行優(yōu)化。以iiPCR儀器內(nèi)存卡中檢測(cè)前讀取的熒光值（A520）與檢測(cè)后讀取的熒光值（B520）的比值R來(lái)判定，取比值R最大時(shí)的相應(yīng)體系為最優(yōu)體系。

2.6 特異性評(píng)價(jià) 用本研究建立的ASFV 防污染iiPCR 方法對(duì)PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的核酸樣本進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)ASFV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照的模板用等量去離子水代替，以評(píng)價(jià)ASFV iiPCR方法的特異性。

2.7 靈敏度測(cè)定 將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋?zhuān)?0n～100）后作為模板，陰性對(duì)照的模板用等量去離子水代替，測(cè)定本研究建立的ASFV 防污染iiPCR方法的檢測(cè)下限。

2.8 穩(wěn)定性驗(yàn)證 用本研究建立的ASFV 防污染iiPCR 方法對(duì)6 個(gè)稀釋度的ASFV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，評(píng)價(jià)其批內(nèi)重復(fù)性；同時(shí)以這些陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每間隔一天進(jìn)行3次獨(dú)立檢測(cè)，檢測(cè)其批間重復(fù)性。

2.9 臨床樣本檢出情況的比較 采用本研究建立的iiPCR 和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部172 號(hào)公告推薦的熒光定量PCR 方法同時(shí)對(duì)51 份ASFV 陽(yáng)性樣本核酸及49 份ASFV 陰性樣本核酸進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)并比較兩種檢測(cè)方法對(duì)ASFV的檢出情況。

3 結(jié)果

3.1 優(yōu)化后的ASFV防污染iiPCR反應(yīng)體系 UNG酶防污染iiPCR反應(yīng)體系的總量為50 μL，優(yōu)化后的體系見(jiàn)表1。

表1 優(yōu)化后的防污染iiPCR反應(yīng)體系

3.2 防污染iiPCR 的特異性 如圖1 所示，用本研究建立的ASFV 防污染iiPCR 方法從ASFV 陽(yáng)性核酸樣本中擴(kuò)增出63 bp 的目的片段，而對(duì)PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該檢測(cè)方法的特異性良好。

圖1 防污染iiPCR檢測(cè)及其產(chǎn)物的電泳結(jié)果

3.3 防污染iiPCR 的靈敏性 用核酸蛋白分析儀測(cè)定ASFV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為176 μg/mL，代入公式換算核酸濃度為2.55×1012拷貝/μL。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋后（2.55×1011～2.55×100），檢測(cè)結(jié)果顯示iiPCR 方法對(duì)ASFV 核酸的最低檢測(cè)限為25.5拷貝/μL。

3.4 防污染iiPCR 的穩(wěn)定性 試驗(yàn)結(jié)果顯示該方法的批內(nèi)變異系數(shù)為0.86%～2.22%，批間變異系數(shù)為1.66%～3.82%（表2）。6個(gè)梯度的變異系數(shù)均小于5%，表明建立的ASFV 防污染iiPCR 方法在批內(nèi)和批間都具有較好的穩(wěn)定性。

表2 防污染iiPCR的穩(wěn)定性

3.5 防污染iiPCR 的效果驗(yàn)證 UNG-ASFV DNA 陽(yáng)性模板的濃度為6.08×1010拷貝/μL，將陽(yáng)性模板梯度稀釋后作為模板（陰性對(duì)照的模板用等量去離子水代替），在37 ℃條件下作用10 min，再根據(jù)最優(yōu)體系來(lái)進(jìn)行iiPCR 擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果顯示：本研究建立的防污染ASFV iiPCR 可以有效消除6.08×105拷貝/μL 的擴(kuò)增產(chǎn)物，表明UNG 酶可以有效防止污染，且UNG酶在PCR預(yù)變性解鏈時(shí)失活，不會(huì)影響PCR后續(xù)反應(yīng)。

3.6 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果的比較 本研究建立的防污染iiPCR與傳統(tǒng)熒光PCR檢測(cè)的符合率見(jiàn)表3。從表3 可見(jiàn)，本研究建立的iiPCR 方法和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦方法對(duì)ASFV陽(yáng)性樣本和陰性樣本的核酸檢測(cè)結(jié)果一一對(duì)應(yīng)，完全一致，表明本研究建立的防污染iiPCR檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠。

表3 兩種方法對(duì)ASFV檢測(cè)結(jié)果的比較

4 討論

4.1 ASFV防污染iiPCR方法的優(yōu)勢(shì) 恒溫隔絕式熒光PCR（iiPCR）是一種基于Rayleigh-Benard對(duì)流原理設(shè)計(jì)的新型熒光PCR技術(shù)，該方法對(duì)于DNA 和RNA 的檢測(cè)都具有極好的靈敏度和特異性［3］。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)，需要瓊脂糖凝膠電泳鑒定的傳統(tǒng)PCR 或熱循環(huán)式PCR 不同的是，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了核酸分析儀的小型化。本研究基于UNG 酶的生物學(xué)特性，在iiPCR 反應(yīng)體系中引入U(xiǎn)NG 酶，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了防污染的ASFV iiPCR 檢測(cè)方法。該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及操作人員的要求不嚴(yán)格，對(duì)PCR反應(yīng)的反應(yīng)性、便捷性和時(shí)效性無(wú)影響，也不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)可以解決陽(yáng)性對(duì)照物及擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)PCR擴(kuò)增體系污染的問(wèn)題，降低假陽(yáng)性的出現(xiàn)概率，提高檢測(cè)方法的可靠性。

Biagetti 等［4］在2018 年建立了加入U(xiǎn)NG 酶的基于嵌合DNA/LNA 的生物傳感器用于檢測(cè)非洲豬瘟病毒的方法，該方法在病毒載量較低時(shí)，檢測(cè)靈敏度顯著降低［5］。本研究用dUTP 取代dTTP，對(duì)ASFV 基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，得到大量含尿嘧啶的U-DNA，將其作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性模板。進(jìn)行PCR 反應(yīng)前在反應(yīng)體系中引入U(xiǎn)NG酶，對(duì)UNG 酶的用量和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。UNG 酶可將污染的含尿嘧啶的U-DNA 水解產(chǎn)生脫嘌呤嘧啶位點(diǎn)，失去模板的功能，而UNG 在預(yù)變性過(guò)程中被滅活而不影響PCR 擴(kuò)增。結(jié)果表明，即使高濃度的U-DNA 污染PCR 反應(yīng)體系，也可以有效防止污染，而且對(duì)PCR 擴(kuò)增無(wú)影響。本方法不僅能快速地消除污染，且上機(jī)檢測(cè)時(shí)間僅需42 min，檢測(cè)速度更快，操作更簡(jiǎn)捷，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和操作人員的要求不高，能夠有效提高ASFV PCR 檢測(cè)的準(zhǔn)確性，防止假陽(yáng)性的出現(xiàn)，為ASFV 的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了一種可靠的防污染方法。

4.2 基于UNG酶的防污染PCR方法的優(yōu)勢(shì) 為了防止PCR 污染，很多技術(shù)方法被應(yīng)用，主要有物理隔絕法，紫外照射法，酶消化法，化學(xué)修飾法，DEAE 纖維素法等，但是這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且效果不理想。物理隔絕法是將PCR 實(shí)驗(yàn)室分為四個(gè)區(qū)域，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格單向進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)），防止雜質(zhì)對(duì)試劑、樣本的污染，但還是無(wú)法避免因氣溶膠產(chǎn)生的污染。紫外照射法操作較簡(jiǎn)單且成本低，但所需時(shí)間較長(zhǎng)。Glushkov 等［6］發(fā)現(xiàn)DEAE法最高能將污染降低106 倍，但是此方法操作過(guò)程較為繁瑣，所需時(shí)間較長(zhǎng)。

UNG 是一種DNA 修復(fù)酶，能識(shí)別并去除DNA 中的尿嘧啶，將試劑中的dNTP 替換成dUTP，在高溫條件下發(fā)生斷裂，在預(yù)變性過(guò)程中UNG 被滅活而不影響后續(xù)PCR 擴(kuò)增［7］。在PCR混合試劑中加入U(xiǎn)NG，每次擴(kuò)展前在37 ℃下作用10 min 左右就能消化可能存在的污染產(chǎn)物，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，整個(gè)過(guò)程也是無(wú)需開(kāi)管，不會(huì)再次污染。這種防污染手段所需時(shí)間較少，操作簡(jiǎn)單，因此利用該酶的這種特性建立的防污染方法在一些病原檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用［8］。