頂空氣相色譜法測定阿尼芬凈關鍵原料對戊氧基三聯苯甲酸中的殘留溶劑

安蘭蘭，張 晴，仲偉潭，祝仕清，李 敏，馬 巖

(華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，河北 石家莊 050000)

阿尼芬凈(Anidulafungin)是第三代棘白霉素類半合成抗真菌藥，由美國Vicuron制藥公司研制，于2006年在美國上市[1]。阿尼芬凈的獨特結構(圖1)使其較其它棘白霉素類抗真菌藥具有更大的分布容積和更廣譜的抗菌活性。阿尼芬凈不經肝代謝和腎消除，用藥安全，耐受性好，在臨床上具有良好的應用前景[1-3]。

圖1 阿尼芬凈的結構式Fig.1 Structural formula of Anidulafungin

對戊氧基三聯苯甲酸(圖2)是合成阿尼芬凈的關鍵起始原料，其合成工藝[4]中需使用正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、二甲苯(對二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯)、二甲基亞砜、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺等有機溶劑。根據《化學藥物殘留溶劑研究的技術指導原則》，應對對戊氧基三聯苯甲酸中有機溶劑殘留量進行檢測與控制。鑒于此，作者根據ICH Q3C(R8)、《中華人民共和國藥典》通則[5]及相關文獻[6-10]建立測定對戊氧基三聯苯甲酸中殘留溶劑的頂空氣相色譜法(headspace gas chromatography，HS-GC)，并進行方法學驗證。

圖2 對戊氧基三聯苯甲酸的結構式Fig.2 Structural formula of p-pentyloxytribenzoic acid

1 實驗

1.1 試劑與儀器

對戊氧基三聯苯甲酸，天津狄克特公司；1-羥基苯并三氮唑(HOBT)，純度99.0%，蘇州昊帆公司；四氫呋喃對照品(分析純)，純度99.0%，天津瑞金特化學品有限公司；乙酸乙酯對照品(分析純)，純度99.5%，天津光復科技發展有限公司；正己烷對照品、二甲基亞砜對照品均為色譜純，純度99.5%，天津科密歐化學試劑有限公司；乙基苯對照品、對二甲苯對照品、鄰二甲苯對照品、間二甲苯對照品均為色譜純，純度99.5%，山東西亞化學工業有限公司；吡咯烷酮(色譜純)。

7890A型氣相色譜儀、7697型頂空進樣器(氫火焰離子化檢測器，FID)，Agilent公司；LabSolutions色譜工作站，日本島津公司；XA205型電子天平(精密度十萬分之一)，瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 溶液的配制

空白溶液：精密稱取HOBT 0.094 g，置于20 mL頂空瓶中，加入吡咯烷酮5 mL，壓蓋密封。

混合對照溶液：分別精密稱取適量正己烷對照品、四氫呋喃對照品、乙基苯對照品、對二甲苯對照品、鄰二甲苯對照品，以吡咯烷酮制成含正己烷2.42 mg·mL-1、四氫呋喃6.00 mg·mL-1、乙基苯3.07 mg·mL-1、對二甲苯2.53 mg·mL-1、鄰二甲苯1.63 mg·mL-1的混合溶液；分別精密稱取適量乙酸乙酯對照品和二甲基亞砜對照品，加入適量混合溶液，以吡咯烷酮制成含正己烷145 μg·mL-1、乙酸乙酯2.5 mg·mL-1、四氫呋喃360 μg·mL-1、乙基苯184 μg·mL-1、對二甲苯152 μg·mL-1、鄰二甲苯98 μg·mL-1、二甲基亞砜2.5 mg·mL-1的混合對照母液；精密量取混合對照母液適量，以吡咯烷酮稀釋10倍，得含正己烷14.5 μg·mL-1、乙酸乙酯250 μg·mL-1、四氫呋喃36 μg·mL-1、乙基苯18.4 μg·mL-1、對二甲苯15.2 μg·mL-1、鄰二甲苯9.8 μg·mL-1、二甲基亞砜250 μg·mL-1的混合對照溶液；精密量取5 mL混合對照溶液，置于20 mL頂空瓶中，壓蓋密封。

供試溶液：分別精密稱取對戊氧基三聯苯甲酸0.25 g、HOBT 0.094 g，置于20 mL頂空瓶中，加入吡咯烷酮5 mL，壓蓋密封。

1.3 色譜條件

色譜柱采用以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷(DB-624)為固定液的毛細管柱(30 m×530 μm,3 μm)；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min；以10 ℃·min-1升溫至95 ℃，保持6 min；以15 ℃·min-1升溫至140 ℃，保持7 min；以30 ℃·min-1升溫至240 ℃，保持10 min；進樣口溫度240 ℃；載氣為高純氮氣；恒定流速1.5 mL·min-1；分流比20∶1；FID溫度250 ℃，補充載氣30 mL·min-1；頂空瓶平衡溫度130 ℃，平衡時間40 min；進樣定量管1 000 μL，進樣時間0.5 min。

2 結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 系統適用性和專屬性

取吡咯烷酮5 mL置于頂空瓶中，分別加入適量目標溶劑正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、間二甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜，壓蓋密封，進行HS-GC分析，保留時間分別為7.823 min、8.799 min、9.374 min、16.691 min、16.938 min、16.957 min、18.020 min、18.784 min。由于間二甲苯、對二甲苯的保留時間相近，其色譜峰不能有效分離，而對二甲苯的控制限度低，故以對二甲苯的限度控制間二甲苯及對二甲苯的加和量。

取空白溶液、混合對照溶液、供試溶液進樣分析，其頂空氣相色譜圖如圖3所示。

由圖3可知，在色譜條件下，各組分均能達到基線分離，分離度均大于1.5，達到藥典要求，理論塔板數為68 353(以正己烷峰計)。表明，其它組分對測定無干擾，該方法專屬性強。

1.正己烷 2.乙酸乙酯 3.四氫呋喃 4.乙基苯

2.1.2 線性關系

配制混合對照溶液，稀釋，使各目標溶劑最高濃度分別為其限度的200%，最低濃度分別為其定量限。以各目標溶劑濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程，結果見表1。

由表1可知，7種目標溶劑的濃度與峰面積線性關系良好，相關系數均在0.999以上。

表1 回歸方程及線性范圍(n=6)

2.1.3 定量限及檢測限

配制混合對照溶液，逐級稀釋，連續進樣測定6次。按信噪比S/N≥10計算定量限，信噪比S/N≥3計算檢測限。測得正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜的定量限分別為0.036 μg·mL-1、0.38 μg·mL-1、0.18 μg·mL-1、0.74 μg·mL-1、0.62 μg·mL-1、0.80 μg·mL-1、20.11 μg·mL-1，檢測限分別為0.015 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.06 μg·mL-1、0.37 μg·mL-1、0.31 μg·mL-1、0.30 μg·mL-1、7.54 μg·mL-1。

2.1.4 精密度

配制混合對照溶液，連續進樣測定6次。測得正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜峰面積的RSD值(n=6)分別為4.2%、4.3%、3.8%、5.1%、5.1%、5.3%、4.5%，均小于10%。表明該方法精密度較好。

2.1.5 重復性

取對戊氧基三聯苯甲酸(批號20190608)適量，配制6份供試溶液，進行HS-GC分析。供試溶液中僅檢出微量的對二甲苯、鄰二甲苯，殘留量分別為0.0038%、0.0024%，RSD值(n=6)分別為 3.1%、4.4%，均小于5%。表明該方法重復性較好。

2.1.6 加標回收率

分別精密稱取對戊氧基三聯苯甲酸(批號20190608)0.25 g、HOBT 0.094 g，共10份，其中1份加入5 mL吡咯烷酮，作為空白溶液；另外9份分別加入低(50%)、中(100%)、高(150%)3個水平的混合對照溶液5 mL，每個加標水平各3份；以混合對照溶液作為對照，進行HS-GC分析，按外標法計算加標回收率，結果見表2。

表2 加標回收率結果(n=9)/%

由表2可知，7種目標溶劑的平均加標回收率分別為89.23%、95.80%、94.74%、95.82%、92.45%、92.80%、104.47%，RSD值分別為4.1%、3.7%、3.2%、5.2%、4.4%、4.3%、3.4%。

2.1.7 穩定性

配制6份混合對照溶液，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h進樣，進行HS-GC分析。測得正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜峰面積的RSD值(n=6)分別為4.2%、4.3%、3.8%、5.1%、5.1%、5.3%、4.5%，均小于10%。表明混合對照溶液在12 h內穩定。

2.2 實際樣品測定

取3批對戊氧基三聯苯甲酸樣品，配制供試溶液，進行HS-GC分析，按外標法計算樣品中殘留溶劑含量，結果見表3。

表3 不同批次樣品測定結果/%

由表3可知，3批對戊氧基三聯苯甲酸樣品中僅檢出少量的對二甲苯和鄰二甲苯，殘留量分別為0.004%、0.002%，均低于限度要求，其它溶劑未檢出。

2.3 討論

2.3.1 溶劑的選擇

由于對戊氧基三聯苯甲酸溶解性較差，分別考察了其在水、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、吡咯烷酮溶液、N,N-二甲基甲酰胺-吡咯烷酮混合溶液、HOBT-吡咯烷酮混合溶液、碳酸鈉溶液、氫氧化鈉溶液中的溶解性，發現對戊氧基三聯苯甲酸在HOBT-吡咯烷酮混合溶液中能完全溶解，且對測定沒有干擾，而在其它溶劑中均不能完全溶解。因此，選用HOBT-吡咯烷酮混合溶液作為溶劑。

2.3.2 頂空條件的優化

分別考察了頂空平衡溫度(120 ℃、130 ℃、140 ℃)、平衡時間(30 min、40 min、50 min)對樣品測定結果的影響。結果發現，平衡溫度為130 ℃時，平衡時間超過40 min后，頂空瓶中氣液兩相已達到平衡，為縮短分析時間，選擇頂空平衡溫度130 ℃、平衡時間40 min。

由于正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜等7種目標溶劑的極性相差較大，因此采用了3次程序升溫過程，能較好地分離目標溶劑，大大縮短了分析時間，滿足了檢測要求。

3 結論

建立了同時測定阿尼芬凈關鍵原料對戊氧基三聯苯甲酸中7種殘留溶劑(正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙基苯、對二甲苯、鄰二甲苯、二甲基亞砜)的頂空氣相色譜法，并進行方法學驗證。結果表明，7種殘留溶劑的濃度與峰面積線性關系良好，相關系數均在0.999以上；7種殘留溶劑的平均加標回收率分別為89.23%、95.80%、94.74%、95.82%、92.45%、92.80%、104.47%，RSD值分別為4.1%、3.7%、3.2%、5.2%、4.4%、4.3%、3.4%。該方法操作簡單、靈敏度高、準確性高、專屬性強，可用于對戊氧基三聯苯甲酸中殘留溶劑的測定，為對戊氧基三聯苯甲酸的質量控制提供了依據。