23S核糖體RNA結構域Ⅴ區位點A2063G、A2064G突變與兒童難治性肺炎支原體肺炎的相關性▲

張碧清 歐書騰 范楚平

(郴州市第一人民醫院兒童呼吸科，湖南省郴州市 423000)

肺炎支原體肺炎好發于兒童，是學齡前兒童常見的社區獲得性呼吸道感染性疾病，約占兒童肺炎的20%[1-2]。肺炎支原體肺炎患兒的臨床表現具有差異性，主要臨床癥狀包括刺激性干咳、喘息、低熱等，而肺部體征不明顯，嚴重時可合并胸腔積液、肺不張等，嚴重影響患兒的健康[3-4]。經過大環內酯類抗生素治療1周以上，臨床癥狀無明顯改善，即為難治性肺炎支原體肺炎。難治性肺炎支原體肺炎患兒的病情進展迅速，臨床表現多變，如不能采取及時、有效的治療措施，患兒可能會出現多系統和器官損害，其健康會受到嚴重危害。而目前臨床上尚無用于治療難治性肺炎支原體肺炎有效且安全性較高的抗生素，這不僅給臨床治療帶來一定的挑戰，而且會給社會帶來嚴重的經濟負擔[5-6]。研究表明，難治性肺炎支原體肺炎與耐藥基因突變存在一定的關系，而耐藥基因23S核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)結構域Ⅴ區位點A2063G、A2064G的突變在抗生素耐藥中扮演著重要的角色[7]，但是尚未有研究明確A2063G、A2064G位點突變與難治性肺炎支原體肺炎的相關性。因此，本研究探討耐藥基因rRNA位點A2063G、A2064G的突變與難治性肺炎支原體肺炎發生的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年3月至2020年3月于我院就診的184例肺炎支原體肺炎患兒。納入標準：(1)符合肺炎支原體肺炎的診斷標準[8]；(2)患兒臨床資料完整；(3)入組前2周內已接受正規大環內酯類藥物抗感染治療，但未接受其他影響觀察指標的藥物治療；(4)患兒家屬均簽署知情同意書。排除標準：(1)合并肺結核者：(2)合并免疫系統疾病者；(3)混合感染者；(4)合并神經精神性疾病不能配合研究者。參照《兒童社區獲得性肺炎管理指南(試行)》[9]關于難治性肺炎支原體肺炎的診斷標準，將患兒分為非難治性肺炎組128例和難治性肺炎組56例。兩組患兒性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經我院醫學倫理委員會批準(倫理批準文號：KL-201904)。

表1 兩組患兒一般資料的比較

1.2 常規實驗室指標檢測 于患兒入院次日，抽取其空腹外周靜脈血5 mL，檢測降鈣素原、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、血沉、ALT、AST、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平，以及白細胞、中性粒細胞計數。使用日立7170型全自動生化分析儀檢測ALT、AST、LDH水平；使用日本Sysmex公司XN9000型全自動血細胞分析儀行血常規檢查；采用魏氏法檢測血沉，檢測儀器為意大利ALIFAX公司的ALIFAX Test 1型全自動血沉分析儀；采用電化學發光免疫法檢測降鈣素原，檢測儀器為廣州羅氏公司E170型分析儀；采用免疫速率比濁法檢測CRP水平，檢測儀器為美國貝克曼庫爾特公司的IMMAGE 800全自動免疫分析儀。正常值范圍如下：降鈣素原水平<0.5 ng/mL；CRP水平<10 mg/L；血沉男性為0～15 mm/h，女性為0～20 mm/h； LDH水平為40～250 U/L；白細胞計數為(3.5～10)×109/L；中性粒細胞計數為(0.5～0.7)×109/L；AST水平為0～40 U/L；ALT水平為0～40 U/L。

1.3 耐藥基因測序 于入院當日，使用無菌生理鹽水浸濕的無菌咽拭子擦拭患兒咽后壁，置于低溫冰箱(-4 ℃)中保存待檢。檢測前將咽拭子加入含有生理鹽水的試管中，進行震蕩搖勻后將液體移至離心管中，室溫下以10 000 r/min離心(離心半徑10 cm)2 min后棄去上清液，加入55 μL DNA裂解液，使用移液槍輕輕吹打混勻，然后加入5 μL的內標基因，在100 ℃條件下處理10 min，再次進行離心。選擇試劑盒弱陽性質控品(含23S rRNA位點A2063G發生突變的基因序列和P1基因序列)、試劑盒強陽性質控品(含23S rRNA位點A2063G發生突變的基因序列和P1基因序列)與樣品進行平衡處理，選擇生理鹽水為陰性對照，試劑盒均購自上海基康生物有限公司(批號：006712、06714)。在試劑盒中取出ddH2O、引物探針和緩沖液并在4 ℃條件下進行融化，將反轉錄酶取出搖勻并在4 ℃下以1 200 r/min離心5 min，使用1支無菌無核酸酶的離心管做標記，加入反轉錄酶0.5 μL、引物探針2.0 μL、緩沖液6.0 μL和11.5 μL ddH2O；向PCR反應管中加入制備好的5.0 μL標本(抽提陰性對照品、質控品W、強弱陽性質控品和樣本)，同時加入5.0 μL無菌水作為陰性對照。PCR擴增參數：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；91 ℃ 15 s；64 ℃ 1 min；40個循環。在64 ℃收集熒光信號，主要包括FAM(2063或2064位點A:G突變)、VIC(肺炎支原體)、CY5(內標)。反應結束后以Ct值顯示結果，如內標的Ct值≤35、FAM的Ct值<35.33、VIC的Ct值<35.01，則為肺炎支原體陽性而且存在耐藥基因23S rRNA位點A2063G和/或A2064G的突變。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；采用Spearman檢驗進行相關性分析，納入有統計學意義的因素進行多因素Logistic回歸分析。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患兒觀察指標的比較 難治性肺炎組的CRP、血沉、LDH水平，中性粒細胞計數，以及A2063G和/或A2064G位點突變的比例均高于非難治性肺炎組(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組患兒觀察指標的比較

組別nAST(x±s,U/L)ALT(x±s,U/L)中性粒細胞計數(x±s,×109/L)A2063G和/或A2064G位點突變[n(%)]難治性肺炎組5626.98±7.1832.71±5.1421.54±6.8254(96.43)非難治性肺炎組12824.98±6.2030.68±6.2710.95±6.3496(75.00) t/χ2值1.0210.9855.83511.875P值0.0620.104<0.0010.001

2.2 CRP、血沉、LDH、中性粒細胞計數、A2063G和/或A2064G位點突變與難治性肺炎支原體肺炎的相關性 CRP、血沉、LDH水平，中性粒細胞計數，以及A2063G和/或A2064G位點突變情況均與難治性肺炎支原體肺炎具有相關性(均P<0.05)，見表3。

表3 實驗室相關指標與難治性肺炎支原體肺炎的相關性

2.3 多因素Logistic回歸分析 以難治性肺炎支原體肺炎為因變量(賦值：是=1，否=0)，以A2063G或/和A2064G位點突變、中性粒細胞計數、CRP、血沉、LDH水平為自變量(基因位點突變賦值：是=1，否=0；其他變量在正常值范圍內賦值為0，超過正常值范圍賦值1)，進行Logistic回歸分析。結果顯示，CRP、血沉、LDH水平升高，以及A2063G或/和A2064G位點突變均是患兒發生難治性肺炎支原體肺炎的危險因素(均P<0.05)，見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析結果

3 討 論

肺炎支原體肺炎是學齡前兒童常見的呼吸道感染性疾病之一。支原體是無細胞壁的微生物，機體感染肺炎支原體時可供選擇的抗生素主要有四環素類、喹諾酮類和大環內酯類抗生素。但是由于喹諾酮類抗生素會損害患兒的腎臟功能及聽力，四環素類抗生素會導致兒童發生腎損傷和牙齒、骨骼損傷，不推薦用于肺炎支原體肺炎患兒的治療，故大環內酯類成為治療肺炎支原體肺炎患兒較為安全的藥物之一[10]。隨著肺炎支原體感染的發病率不斷增加，大環內酯類藥物的耐藥問題成為亟需解決的難題。既往研究表明，難治性肺炎支原體肺炎與大環內酯類抗生素耐藥、合并其他病原菌感染、誤診誤治、免疫應答異常相關，其中大環內酯類抗生素耐藥是導致難治性肺炎支原體肺炎的主要致病因素[11]。因此，本研究探討相關耐藥基因位點突變與難治性肺炎支原體肺炎的相關性。

核糖體是支原體合成蛋白質的主要場合，大環內酯類抗生素的耐藥機制主要是導致結合MP50S大亞基的23S rRNA結構域Ⅴ區和Ⅱ區發生基因突變，從而使得核糖體與抗生素的親和力下降，阻礙蛋白質合成導致抗生素耐藥[12]。研究表明，支原體對大環內酯類抗生素耐藥的機制主要有靶位改變、基因甲基化酶修飾和靶基因23S rRNA突變，其中靶基因23S rRNA突變是目前臨床關注和研究的重點[13]。23S rRNA結構域Ⅴ區A2063G、A2064G是其最常見的突變位點。因此，我們推測23S rRNA結構域Ⅴ區位點A2063G、A2064G突變與難治性肺炎支原體肺炎可能存在相關性。本研究結果顯示，難治性肺炎組患兒的CRP、血沉、LDH水平，中性粒細胞計數，以及A2063G和/或A2064G位點突變的比例均高于非難治性肺炎組(均P<0.05)；而CRP、血沉、LDH水平，中性粒細胞計數，以及A2063G或/和A2064G位點突變均與難治性肺炎支原體肺炎具有相關性(均P<0.05)；進一步進行Logistic回歸分析，結果顯示，校正了CRP、血沉、LDH等實驗室指標后，A2063G或/和A2064G位點突變仍是患兒發生難治性肺炎支原體肺炎的危險因素(P<0.05)，這印證了上述的推測。23S rRNA結構域Ⅴ區位點A2063G、A2064G突變會進一步導致病原菌靶位改變、主動外排藥物和藥物滅活等，使大環內酯類抗生素不能發揮作用，導致肺炎支原體肺炎患兒自身免疫紊亂，病情加重[14]。因此，對于難治性肺炎支原體肺炎患兒，在臨床治療中應該積極尋找更加安全有效的藥物。

綜上所述，存在23S rRNA結構域Ⅴ區位點A2063G、A2064G突變的肺炎支原體肺炎患兒發展為難治性肺炎支原體肺炎的概率更大，可根據該指標判斷肺炎支原體肺炎患兒出現難治性肺炎支原體肺炎的可能性，進而制定合理、安全的用藥方案，以盡快改善患兒癥狀、縮短患兒的住院時間和治療時間，從而減輕患兒的身心負擔和家庭經濟負擔。