甘草甜素對人急性髓系白血病細胞增殖、凋亡及AMPK/MTOR信號通路的影響▲

蔣 鑫 王 希 朱春霞 李成龍

(都江堰市人民醫院1 血液科，2 檢驗科，四川省都江堰市 611830；3 四川省醫學科學院·四川省人民醫院血液內科，四川省成都市 610031)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是由髓樣祖細胞引起的致死性血液惡性腫瘤，是成人最常見的急性白血病類型，其特征是處在不同階段的髓樣祖細胞成熟停滯而惡性增殖，同時白血病細胞凋亡受損，這是一種異質性疾病，可導致人類造血細胞的整體減少[1-3]。化療結合造血干細胞移植是AML的首選治療方法，也是其主要治療方法[4]。雖然目前治療技術取得了很大進步，但治療后AML患者的復發率很高，總生存率仍然很低[5]。因此，尋找新的治療方法以降低復發率，對于提高AML患者的生存率極為重要。甘草甜素也稱為甘草酸，是甘草的有效成分，它具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤和保肝等多種藥理特性[6]。Hibasami等[7]研究發現，甘草甜素可誘導人AML細胞 HL-60發生凋亡。腺苷單磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，MTOR)信號通路在細胞生長、增殖、凋亡、遷移等過程中具有重要作用[8]。抑制MTOR并激活AMPK的藥物在治療AML方面具有很好的應用前景[9]。目前關于甘草甜素對AMPK/MTOR信號通路的作用鮮見報告。因此，本研究探究甘草甜素對AML細胞HL-60增殖和凋亡的影響，并分析其是否通過AMPK/MTOR通路發揮作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 HL-60細胞購自中國科學院細胞庫。CCK-8試劑盒購自美國Abcam公司(貨號：ab228554)。Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：C1062)、Hoechst 33342染色液(貨號：C1025)均購自上海碧云天生物有限公司。B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)一抗(貨號：15071)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗(貨號：89477)、MTOR一抗(貨號：2983)、磷酸化MTOR(phosphorylated MTOR,p-MTOR)一抗(貨號：5536)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)一抗(貨號：13110)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)一抗(貨號：55506)、活化型Caspase3(cleaved Caspase-3)一抗(貨號：9664)、羊抗兔二抗(貨號：7074)、β-actin一抗(貨號：4970)均購自美國Cell Signaling Technology公司。AMPK一抗(貨號：MA5-15815)、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)一抗(貨號：44-1150G)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。RPMI 1640完全培養基(貨號：31800022)、胎牛血清(貨號：S9020)均購自北京索萊寶科技有限公司。甘草甜素[純度≥98%(高效液相色譜法)；貨號：IG0730]和二甲基亞砜(純度>99.5%；貨號：D8371)均購自北京索萊寶科技有限公司。碘化丙啶(純度≥94.0%；產品編號：ST1569)購自上海碧云天生物有限公司。

1.2 實驗儀器 Forma CO2細胞培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司，ZS-AE7S型中生流式細胞儀購自中生(蘇州)醫療科技有限公司，BX53型電子熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，GelDoc XR型凝膠成像儀、550型全自動酶標儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養與分組干預：復蘇HL-60細胞后，使用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640完全培養基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中常規培養，連續傳代，培養至生長對數期備用。將處于生長對數期的細胞分為對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組，在甘草甜素低、中、高劑量組細胞中分別加入終濃度為0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL的甘草甜素，在對照組細胞中加入等體積的二甲基亞砜。

1.3.2 CCK-8法評估細胞增殖情況：將HL-60細胞接種于96孔板中，接種密度為2×104個/孔，按1.3.1方法處理各組細胞，48 h后每孔分別加入10 μL的CCK-8溶液，設3個復孔。在37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育4 h后，使用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值。計算存活率(%)=實驗組單個樣本吸光度值/對照組所有樣本平均吸光度值×100。實驗重復6次。

1.3.3 細胞克隆實驗：將細胞以400個/孔接種于6孔板，使其均勻分布。按照1.3.1方法處理細胞，24 h后取出細胞制成細胞懸液，再將細胞懸液置于37 ℃、5% CO2的培養箱中靜置培養1周后，使用多聚甲醛固定細胞，1%結晶紫染色。計數每組的細胞克隆數，以>25個細胞聚集時設定為1個有效細胞克隆。實驗重復6次。

1.3.4 流式細胞術分析細胞凋亡情況：將HL-60細胞以5×104個/mL、2 mL/孔接種于6孔板中，按照1.3.1方法處理各組細胞，設3個復孔，48 h后收集細胞并用預冷的PBS洗滌細胞3次，30 s/次，然后將細胞重懸于含有Annexin Ⅴ的FITC和碘化丙啶結合的緩沖液中，在室溫下孵育15 min，使用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。實驗重復6次。

1.3.5 Hoechst 33342染色法檢測細胞凋亡情況：將HL-60細胞以2×105個/mL、2 mL/孔接種于6孔板中，按照1.3.1方法處理各組細胞，設3個復孔，48 h后收集細胞，使用PBS清洗30 s后，用4%多聚甲醛固定細胞10 min，再用PBS清洗30 s，隨后在室溫下用Hoechst 33342避光染色細胞10 min，再次使用PBS清洗后置于熒光顯微鏡下觀察拍照。隨機選取5個視野，在400倍鏡下進行觀察。若觀察到細胞核碎裂或細胞皺縮，則判定為凋亡的細胞。實驗重復6次。

1.3.6 Western blot分析蛋白表達水平：將HL-60細胞以2×105個/mL、2 mL/孔接種于6孔板中，按照1.3.1方法處理各組細胞，設3個復孔，48 h后收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞3次，30 s/次，加入蛋白酶抑制劑和細胞裂解液提取細胞總蛋白并檢測蛋白濃度。經SDS-PAGE電泳分離蛋白后，將蛋白轉移到PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉PVDF膜2 h，然后4 ℃孵一抗(PCNA、cyclin D1、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、AMPK、p-AMPK、MTOR、p-MTOR的稀釋倍數為1 ∶500，β-actin的稀釋倍數為(1 ∶1 000)過夜，用TBST洗膜3次，10 min/次，然后在室溫下孵育二抗(稀釋倍數為1 ∶2 000)2 h，再次用TBST洗膜3次，10 min/次，通過增強化學發光檢測試劑曝光顯色，以β-actin為內參蛋白，使用凝膠成像系統進行分析灰度值，以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平。實驗重復6次。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 甘草甜素對HL-60細胞增殖的影響 4組HL-60細胞存活率差異具有統計學意義(P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細胞存活率依次降低(均P<0.05)。見表1。

表1 4組HL-60細胞存活率的比較(x±s，%)

2.2 甘草甜素對HL-60細胞克隆形成的影響 4組的HL-60細胞有效克隆數差異具有統計學意義(P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細胞有效克隆數依次減少(均P<0.05)。見表2。

表2 4組HL-60細胞有效克隆數的比較(x±s，個)

2.3 甘草甜素對HL-60細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，4組HL-60細胞的凋亡率差異具有統計學意義(P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組HL-60細胞的凋亡率依次升高(均P<0.05)，見圖1和表3。Hoechst 33342染色結果顯示，與對照組相比，甘草甜素各劑量組中核碎片和凝結的HL-60細胞比例明顯增加，HL-60細胞凋亡率升高，見圖2。

圖1 流式細胞儀檢測結果

表3 4組HL-60細胞凋亡率的比較(x±s，%)

圖2 Hoechst 33342染色結果(×400)

2.4 甘草甜素對HL-60細胞增殖相關蛋白表達水平的影響 4組HL-60細胞的PCNA、cyclin D1蛋白表達水平差異均有統計學意義(均P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組HL-60細胞的PCNA、cyclin D1蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)。見圖3和表4。

圖3 4組增殖相關蛋白的表達情況

表4 4組細胞增殖相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.5 甘草甜素對HL-60細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響 4組HL-60細胞Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達水平差異均有統計學意義(均P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細胞Bcl-2蛋白表達水平依次降低，Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達水平依次升高(均P<0.05)。見圖4和表5。

圖4 4組凋亡相關蛋白的表達情況

表5 4組細胞凋亡相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.6 甘草甜素對HL-60細胞AMPK/MTOR通路相關蛋白表達水平的影響 4組HL-60細胞的p-AMPK、p-MTOR蛋白表達水平差異均有統計學意義(均P<0.05)，對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細胞p-AMPK蛋白表達水平依次升高(均P<0.05)，p-MTOR蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)。但4組HL-60細胞的AMPK和MTOR蛋白表達水平差異無統計學意義(均P>0.05)。見圖5和表6。

圖5 4組 AMPK/MTOR通路相關蛋白的表達情況

表6 4組均AMPK/MTOR通路相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

AML是一組異質性造血系統疾病，其特征為多種遺傳/表觀遺傳變異，以及造血干細胞和髓系祖細胞分化、增殖和自我更新的改變[10]。化療是治療AML最常用的方法，但它也會殺死正常細胞，從而引起多種不良反應[11]。研發替代治療策略以降低化療引起的不良反應，具有重要意義。甘草甜素是甘草根的成分，是一種三萜皂苷[12]。已知甘草甜素的抗癌機制包括抑制細胞增殖、轉移，以及誘導細胞周期停滯、凋亡[13]。研究表明，甘草甜素可抑制人食管癌細胞ECA109和肝癌細胞MHCC97-H的增殖[14-15]，并能夠以時間和劑量依賴性的方式抑制前列腺癌細胞的增殖[16]。本研究結果顯示，給予甘草甜素干預后，HL-60細胞生長受到抑制，與增殖相關的PCNA、cyclin D1蛋白表達水平均降低(均P<0.05)，且具有一定的劑量依賴性，表明甘草甜素可抑制HL-60的細胞增殖，對AML具有一定的治療作用。

凋亡是一種細胞死亡過程，受不同分子機制的調節，其中Caspase在凋亡的激活中起著至關重要的作用。人類癌癥細胞的基本特征之一是逃避凋亡，這使得腫瘤進一步發展并對治療產生抵抗性[17]。有學者發現，甘草甜素可以促進口腔鱗狀細胞癌細胞、肝癌細胞的凋亡[18-19]。Bcl-2蛋白家族包括促凋亡蛋白Bad、Bid、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x、Mcl-1。Bcl-2可通過介導線粒體釋放細胞色素C至細胞質來調控細胞凋亡，從而激活下游無活性的Caspase-9并使Caspase-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶活化，進而誘導細胞凋亡[20-21]。本研究結果顯示，與對照組相比，甘草甜素各劑量組的HL-60細胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達水平下調，cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達水平上調，且呈劑量依賴關系，表明甘草甜素可調控凋亡相關蛋白的表達，促進HL-60細胞凋亡。

AML細胞的增殖與AMPK/MTOR信號通路密切相關。AMPK是一種細胞能量傳感器，是調節細胞能量和代謝的關鍵因子，可通過調節多個下游信號分子促進細胞凋亡，在髓系惡性腫瘤的促分化中發揮重要作用[22]。MTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白質激酶，激活AMPK可抑制MTOR信號傳導并促進細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤效應[23]。有研究顯示，辛伐他汀對鼻咽癌CNE-2細胞增殖的抑制作用和細胞凋亡的促進作用與AMPK/MTOR信號通路有關[24]；而亞硒酸鈉可激活AMPK，抑制MTOR活化，從而促進結直腸癌HT-29細胞凋亡[25]。本研究結果顯示，在甘草甜素作用下，HL-60細胞的p-AMPK蛋白表達水平升高，p-MTOR蛋白水表達平降低，表明甘草甜素可促進AMPK磷酸化，抑制MTOR磷酸化水平，進而誘導細胞凋亡。

綜上所述，甘草甜素有效抑制HL-60細胞增殖、促進細胞凋亡，且呈一定的劑量依賴性，其機制可能與促進AMPK的磷酸化水平、抑制MTOR磷酸化有關。