火龍果采后病原菌的分離鑒定及丁香酚抑菌研究*

羅冬蘭，雷霽卿，曹 森，瞿光凡，朱 婷，陳建業，范中奇，巴良杰

（1 貴陽學院，貴州550005）（2 華南農業大學）（3 福建農林大學）

火龍果原產于墨西哥、中美洲等熱帶地區，以肉色不同將其分為紅肉、白肉、黃肉火龍果[1]。其中，紅肉火龍果因其富含較高的營養物質、獨特的風味深受消費者喜愛[2]。然而，火龍果成熟期為高溫多雨季節，采后田間熱、較高的呼吸強度極易受病原菌的侵染，從而引起果實快速腐爛變質，貨架期短[3-4]。據報道，火龍果采后主要病害有炭疽病、黑斑病、果腐病、潰瘍病、軟腐病[5]。病原菌的侵染是導致采后火龍果品質劣變的主要因素。因此，控制果實采后病害發生對提高果實商品價值和產業發展尤其重要。

丁香酚作為一種天然的植物精油，其揮發性成分主要有菇烯、菇類化合物和酚類物質，具有抑菌活性和誘導增強果蔬抗氧化等作用[6]。周丹丹等[7]研究發現，1 μL/L 丁香酚處理能有效抑制枇杷采后炭疽病的發生，在貯藏6 d 時，其對尖孢炭疽菌的抑制率為66.7%。葛達娥等[8]研究結果表明，丁香酚通過破壞鏈格孢菌的細胞膜通透性，抑制菌絲生長和孢子萌發，從而有效抑制藍莓采后黑斑病的發生。此外，米嘉琦等[9]研究發現，丁香酚處理不僅抑制芒果采后炭疽病的發生，還有效降低了芒果的腐爛率。然而，關于丁香酚對火龍果采后病原菌的抑制研究未見報道。本研究對自然發病的火龍果進行病原菌的分離鑒定，并篩選適宜濃度的丁香酚對病原菌進行抑制研究，以期為火龍果采后病害的防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

火龍果鮮果于2021 年9 月11 日從貴州省羅甸縣火龍果種植基地采摘，選取健康、無病蟲害果實用PE20 袋進行單個包裝，并置于溫度20 ℃、空氣相對濕度85%條件下貯藏，定期觀察果實發病情況。病原菌的分離培養基為PDA 培養基（馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL）。

火龍果采后病原菌的形態特征及致病性測定結果Morphological characteristics of postharvest pathogens of pitaya fruit and its pathogenicity test results

1.2 火龍果采后優勢菌分離

采用組織分離法對病原菌進行分離[10]。將自然發病的果實置于75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次，再用無菌吸水紙將果皮水分擦干，采用無菌手術刀切取果實病健交界處組織，放于PDA 培養基上，經過多次劃線分離、單孢培養直至獲得純化菌株，并將純化菌株于4 ℃保存備用。

1.3 病原菌傳統形態學觀察

將分離的病原菌接種在新的PDA 平板上培養15 d，觀察記錄分離菌株的菌落生長情況，利用光學顯微鏡觀察記錄菌絲和孢子的形態結構特征，并參照《真菌鑒定手冊》[11]對病原菌進行初步鑒定。

1.4 病原菌致病性檢測

將火龍果果實用無菌水清洗后，在75%酒精中浸泡30 s，再用無菌水清洗3 次，用無菌打孔器在果實赤道處刺直徑4 mm、深3 mm 的傷口，在傷口處分別接種培養5 d 病原菌菌餅，以無菌菌餅作為對照，每株病原菌3 個果。置于溫度25 ℃、空氣相對濕度80%～90%條件下恒溫培養4 d 后觀察記錄果實發病情況，根據柯赫氏法則對病原菌進行致病性檢測[12-13]。

1.5 病原菌rDNA-ITS 序列分析

1.5.1 病原菌DNA 提取

取一定量純化后培養5 d 的病原菌菌絲，參照真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒（生工生物工程）提取病原菌DNA。

1.5.2 病原菌ITS 區PCR 擴增及凝膠電泳

選用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′）進行PCR 擴增。PCR 反應體系：TaqMast erMix 110 μL、ITS1 和ITS4 1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O2補加至20 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃終延伸10 min[14]。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，寄送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI 網站的GenBank 數據庫中進行BLAST 同源性比對分析。

1.6 丁香酚對火龍果病原菌體外抑菌效果

采用菌絲生長速率法[15]測定丁香酚對火龍果采后病原菌菌絲生長的影響。稱取一定質量丁香酚液配制成10 mg/mL 母液，分別吸取一定量的母液加入到10 mL PDA 培養基中，使得丁香酚質量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL，充分搖勻后倒入無菌培養皿中，備用。用無菌打孔器從純化后培養5～7 d 的病原菌菌落邊緣打取直徑4 mm 菌餅放于PDA 培養基中央，以不加丁香酚培養基作為對照（CK），每個處理3 次重復。28 ℃培養7 d 或對照組長滿整個培養基后測量菌落直徑，并參照王丹等[16]方法計算抑菌率。

1.7 數據處理

采用Excel 2016 軟件進行數據統計，采用SPSS Statistics 23 軟件的Duncan’s 法對數據進行差異顯著性分析，采用Origin 2018 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 火龍果自然發病癥狀

貯藏3 d 后，果實鱗片開始萎蔫；貯藏5 d 后，局部鱗片和果柄處長出少量菌絲；貯藏8 d 后，果柄處長出大量白色、灰色和灰白色菌絲，肉眼可見，并覆蓋整個果柄面，菌絲逐漸向果身擴展；同時，果柄周圍果皮褐腐潰爛，果皮出現許多小黑點（圖版1-a），失去食用價值。

2.2 病原菌的形態特征

將自然發病的火龍果果實采用組織塊分離法分離得到4 株病原菌，記作H-1、H-2、H-3 和H-4。菌株H-1 在PDA 培養基上培養（圖版1-b-A1～A3），菌絲生長較快，初期為灰白色棉絮狀，后期變為灰黑色或暗灰色，菌落基質初期為暗黃色，后期變為棕褐色；在顯微鏡下觀察發現，菌落培養7 d后產生成熟的分生孢子，孢子呈橢圓形、卵圓形或短棒形，孢子兩端鈍圓，無色，無膈膜，串珠狀排列。根據其形態特征并參照真菌分類手冊，初步鑒定為新暗色柱節孢菌（Neoscytalidium dimidiatum）。

菌株H-2在PDA培養基上培養（圖版1-b-B1～B3），菌絲初期為白色，后逐漸變為淡棕色，后期呈紅棕色，并分泌紅褐色色素；菌落基質呈現明顯同心輪紋，外層暗黃色，內層紅棕色；菌落培養7～15 d 產生分生孢子，分生孢子呈球形、近球形，無膈膜。根據其形態特征并參照真菌分類手冊，初步鑒定為黑附球菌（Epicoccum nigrum）。

菌株H-3 在PDA 培養基上培養（圖版1-b-C1～C3），初期為白色絨毛狀，后期變為淺黃色；菌落基質初期為米黃色，后期呈黃棕色；培養5 d 后產生分生孢子，分生孢子彎曲顯著或微彎，呈鐮刀形，有膈膜，橫膈膜1～3 個，無色。根據其形態特征并參照真菌分類手冊，初步鑒定為鐮刀菌屬（Fusariumsp.）。

菌株H-4 在PDA 培養基上培養（圖版1-b-D1～D3），菌落初期為白色絨毛狀，菌絲呈網狀形展開生長，后期變為暗黃色；菌落基質初期為米黃色，后期呈暗黃棕色或暗灰色；在顯微鏡下觀察發現，菌絲粗壯，內有油球，菌落培養7 d 后，產生分生孢子，孢子呈球形、近球形，無膈膜。根據其形態特征并參照真菌分類手冊，初步鑒定為球黑孢菌（Nigrospora sphaerica）。

2.3 病原菌的致病性測定結果

選取無病蟲害、無機械損傷的果實，將果實置于75%酒精中浸泡30 s，無菌水沖洗2～3 次后放于超凈工作臺中自然晾干，備用。采用刺傷接種法將菌株H-1、H-2、H-3 和H-4 分別接種至火龍果果實上，對照組接無菌菌餅，并將果實置于溫度25 ℃、空氣相對濕度85%條件下貯藏4 d。刺傷接種菌株H-1（圖版1-c-A）果實，刺傷部位長出灰白色菌絲，果實開始褐腐潰爛。刺傷接種菌株H-2（圖版1-c-B）、H-3（圖版1-c-C）、H-4（圖版1-c-D）引起火龍果致病，其刺傷部位長出大量菌絲，肉眼可見，對照組均無發病。取接種發病果實組織再次進行分離，分離得到的菌株與原菌株培養性狀一致。

2.4 病原菌的分子生物學鑒定

將火龍果病原菌PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到4 株病原菌序列長度均為500～700 bp；并將其產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果提交NCBI 網站的GenBank數據庫中進行BLAST 同源性比對分析，并下載同源較高的序列，采用鄰近法構建系統發育樹（圖1）。由系統進化樹分析結果得知，菌株H-1 與Neoscytalidium dimidiatum具有較高的同源性，其相似度高達100%，結合其形態特征鑒定為新暗色柱節孢菌；菌株H-2 與Epicoccum nigrum處于同一分支，相似度達91%，結合其形態特征鑒定為黑附球菌；菌株H-3 與Fusarium oxysporum有較高同源性，相似度達99%，結合其形態特征鑒定為尖孢鐮刀菌；菌株H-4 與Nigrospora sphaerica有較高的同源性，相似度達100%，結合其形態特征鑒定為球黑孢菌。

圖1 火龍果4 株病原菌的rDNA-ITS 序列PCR 電泳圖及系統發育樹

2.5 丁香酚對火龍果病原菌菌絲抑制及室內毒力測定

2.5.1 丁香酚對病原菌菌絲抑制效果

不同質量濃度丁香酚對火龍果采后病原菌菌絲生長抑制效果見表1。由表1 可知，隨著丁香酚質量濃度的增加，其對4 株病原菌的抑制率呈遞增趨勢，且不同濃度間抑制效果差異顯著。當丁香酚濃度為0.20 mg/mL 時，對4 株病原菌的抑制率大于70%，其中，完全抑制F.oxysporum生長。當丁香酚濃度為0.25 mg/mL 時，對N.dimidiatum、E.nigrum、F.oxysporum和N.sphaerica的抑菌率分別為87.66%、97.49%、100.00%和95.07%。由此可見，丁香酚對火龍果采后病害的防治具有潛在的應用價值。

表1 丁香酚對火龍果采后病原菌菌絲生長的抑制效果

2.5.2 丁香酚對病原菌菌絲室內毒力測試

通過菌絲生長抑制試驗，求出丁香酚對4 株病原菌菌絲毒力回歸方程及EC50，結果見表2。由表2可知，F.oxysporum對丁香酚的敏感性最高，EC50為0.114 7 mg/mL，其他依次為E.nigrum、N.sphaerica、N.dimidiatum，EC50分別為0.128 3、0.156 0、0.174 8 mg/L。

表2 丁香酚對火龍果采后病原菌菌絲生長的毒力回歸方程

3 討論與結論

近年來，火龍果采后病害的發生造成嚴重的經濟損失。據前人研究報道，崔志婧等[17]研究發現，上海市進口火龍果軟腐病主要由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和單隔鐮刀菌（Fusarium dimerum）引起；郭力維等[18]認為，引起云南火龍果果腐病的病原菌為霜霉目白秀科桃吉爾霉（Gilbertella persicaria）；Guo 等[19]首次發現平頭炭疽菌（Colletotrichum truncatum）可引起火龍果炭疽病發生；王會會等[20]發現引起火龍果潰瘍病的致病菌為新暗色柱節孢菌。此外，胡翠平等[21]還發現，引起廣西白心火龍果采后腐爛的致病菌為新月彎孢菌（Curvularia lunata）。綜上研究報道可知，引起火龍果腐爛的病原菌種類較多，且致病力可能與火龍果品種、病原菌種類及區域條件有關。本研究從自然發病的火龍果果實分離病原菌，并經過致病性測定、形態學及分子生物學鑒定，確定引起貴州省羅甸縣火龍果采后腐爛的病原菌主要是新暗色柱節孢菌（Neoscytalidium dimidiatum）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和球黑孢菌（Nigrospora sphaerica）。

丁香酚不僅具有廣譜殺菌性，而且在果蔬采后保鮮上具有潛在的應用價值；能夠有效提高枇杷[7]、草莓[22]的貯藏品質，降低青茄[23]冷害發生，抑制蘋果[6]采后病原菌生長。本研究發現，丁香酚對火龍果采后病原菌具有較好的控制效果。其中，當丁香酚濃度為0.20 mg/mL 時，其對4 株病原菌的抑制率均大于70%。通過毒力測試發現，丁香酚對F.oxysporum抑制效果最顯著，EC50為0.114 7 mg/mL，其次為E.nigrum、N.sphaerica、N.dimidiatum，EC50分別為0.128 3、0.156 0、0.174 8 mg/L。因此，丁香酚可應用于火龍果采后病害防控。然而，關于丁香酚對火龍果采后病原菌的抑菌機理及貯藏保鮮效果還需進一步的研究。