鐵蛋白納米載體在營養與健康領域的應用研究進展

劉 博，張晨曦，臧佳辰，呂晨艷，張 拓,2,*，趙廣華

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國農業大學食品功能膠體與軟物質研究中心，北京 100083）

鐵蛋白是廣泛存在于生物體中的一種鐵儲藏蛋白，其主要生物學功能有兩種：一是將二價鐵離子轉化成可溶無毒且生物可利用的三價鐵形式并儲存于蛋白質內部空腔，調節鐵代謝平衡；二是清除亞鐵離子介導的自由基反應，保護細胞免受氧化性損傷。天然的鐵蛋白由蛋白質外殼和內部鐵核兩部分組成，外殼是由24 個相同或不同的亞基構成的具有高度對稱結構的中空籠狀蛋白質分子，鐵核則是由大量氫氧化鐵和磷酸鹽組成。在無氧條件下可利用還原反應將鐵核去除，從而制備得到具有內部空腔的脫鐵鐵蛋白外殼。鐵蛋白的籠狀外殼非常穩定，具有較強的酸堿耐受性（pH 2.0～12.0）以及熱穩定性（蛋白質變性溫度為70～80 ℃）。鐵蛋白的高級結構主要是由亞基間的氫鍵和疏水作用維持，故可以通過物理化學的手段將其亞基解離及重新組裝，其可逆的解離重組特性為鐵蛋白納米籠作為包埋外殼以及遞送載體的應用奠定了基礎。

由于鐵蛋白納米籠獨特的結構、優良的理化性質和良好的生物相容性，其內部空腔被廣泛地用于封裝無機或有機客體分子，應用于食品營養、生物醫藥與納米材料等領域。鐵蛋白作為納米載體具有以下優勢：第一，鐵蛋白封裝納米顆粒尺寸較小且均一性好，一般為12 nm左右。第二，生理條件下，鐵蛋白在細胞內或血液中具有良好的溶解性和穩定性。第三，鐵蛋白在特定條件（如強酸或者強堿）下可解離成單亞基，而當恢復至生理環境時，鐵蛋白又可以重新組裝成籠形結構且性質不變。利用這種可逆自組裝特性，客體分子可以容易地被包埋進內部空腔中。第四，鐵蛋白的界面位置容易進行遺傳或化學修飾以賦予其他功能性。目前為止，鐵蛋白已被廣泛用于包埋花青素、姜黃素、蘆丁等多種食品營養素以提高其水溶性、穩定性以及細胞吸收率，利用鐵蛋白裝載抗癌藥物、造影劑等成分可用于實現藥物的靶向傳遞、細胞成像以及腫瘤治療等研究。此外，由于天然蛋白質結構單一，鐵蛋白也被科學家們廣泛用于人工設計制造不同結構性質的新型籠形蛋白，這極大拓展了鐵蛋白作為納米載體的應用范圍。本篇綜述對鐵蛋白分子的結構特點進行系統總結，并重點介紹其作為納米載體應用于食品科學、營養健康及醫藥成像等領域的研究進展。

1 鐵蛋白的結構

1.1 鐵蛋白的典型結構特征

不同來源鐵蛋白的亞基種類與氨基酸組成有一定差異，但其空間結構具有很高的保守性。典型的鐵蛋白結構是由24 個相同或相似的亞基自組裝形成的一種中空籠狀分子，內外徑分別約為8 nm和12 nm。鐵蛋白亞基的外形近似圓柱體，長、寬分別約5.0、2.5 nm。亞基結構由1 個兩兩成反向平行的螺旋簇（A、B和C、D螺旋）和1 個較短螺旋（E螺旋）組成，B和C螺旋之間由一段被稱為BC-環的氨基酸鏈連接，E螺旋位于螺旋簇的尾端并與之成60°夾角（圖1A）。鐵蛋白亞基的氨基端、BC-環、A螺旋和C螺旋構成鐵蛋白的外表面，B螺旋和D螺旋則位于內表面。鐵蛋白內表面富含谷氨酸、天冬氨酸等酸性氨基酸殘基，因此在pH值為中性的條件下，鐵蛋白內表面具有較高的負電荷密度，而外表面的凈電荷接近于零或略帶正電荷。

鐵蛋白分子具有3 種化學性質不同的活性界面：內表面、外表面、亞基間界面（圖1B），而這3 種界面均可通過化學和基因手段進行修飾來實現鐵蛋白的功能調控。化學修飾指將染料分子、猝滅劑等功能性小分子與鐵蛋白特定氨基酸進行化學偶聯，基因修飾是定點突變、添加或刪除特定氨基酸改變鐵蛋白的基因序列。鐵蛋白外表面偶聯修飾一些官能團可賦予其發光成像等特性，內表面主要是作為納米反應器合成無機納米材料或用于包埋活性營養小分子，亞基間界面則可用于調控鐵蛋白分子的解離重組以及設計新型籠狀蛋白。通過對這3 種活性界面的修飾和改造，可以拓展鐵蛋白分子應用空間。

作為一種典型的籠形蛋白，鐵蛋白分子通過亞基界面之間的復雜而精確的作用力自組裝形成具有高度對稱性的四級結構。參與鐵蛋白籠狀結構組裝的亞基間界面包括C、C、C以及C-C界面，其中C和C-C界面是維持亞基間相互作用的主要區域（圖1C）。一般認為鐵蛋白的亞基先形成1 個反向平行的二聚體，之后二聚體形成鐵蛋白的四級結構，若把二聚體當作1 個面，鐵蛋白則為一種呈4-3-2點對稱的菱形十二面體。該十二面體上沿二、三、四重旋轉軸分別為鐵蛋白亞基與亞基之間組成的12 個二重軸通道、8 個三重軸通道、6 個四重軸通道。其中鐵蛋白的三重軸通道和四重軸通道的孔徑在0.3～0.5 nm之間，起到連接內部空腔和外部環境的作用。金屬離子和帶正電荷的小于鐵蛋白通道孔徑的有機小分子可以通過靜電吸引擴散到空腔中，但大分子由于空間位阻則不能通過鐵蛋白通道進入內部空腔。

圖1 鐵蛋白結構特征Fig. 1 Structural characteristics of ferritin

1.2 不同來源天然鐵蛋白特征

動物鐵蛋白通常由功能差異很大的H型（重鏈，分子質量約為21 kDa）和L型（輕鏈，分子質量約為19.5 kDa）兩種亞基組成。H型亞基包含1 個亞鐵氧化中心，可將二價鐵離子氧化成三價鐵離子。1 個亞鐵氧化中心能夠同時結合2 個二價鐵離子，亞鐵氧化中心包含2 個鐵離子結合位點，A位點由Glu27、Glu61、Glu62、His65和Glu107 5 個氨基酸殘基構成，B位點由Tyr34和Gln141兩個氨基酸殘基構成。L型亞基不具備氧化亞鐵離子的功能，但其具有1 個成核中心，負責將氧化后的三價鐵離子轉化為礦化核。鐵蛋白H和L亞基的比例在不同器官和組織中有所區別，腦、心臟等代謝旺盛的器官中鐵蛋白富含H亞基，而脾臟和肝臟等器官中鐵蛋白L亞基比例較高。H和L亞基可分別專一識別人體細胞的表面受體，一種是轉鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）1，特異性識別鐵蛋白H型亞基；另一種是清道夫A類受體5號蛋白，負責識別結合鐵蛋白L型亞基。

植物鐵蛋白的24 個亞基均為具有亞鐵氧化中心的H型亞基，其氨基酸組成與動物鐵蛋白H型亞基相似度約為40%。從豌豆、大豆、黑豆、玉米、苜蓿和擬南芥等植物體中分離得到的植物鐵蛋白都是由H-1亞基（26.5 kDa）和H-2亞基（28.0 kDa）以不同的比例組成，H-1與H-2亞基氨基酸序列同源性為80%。成熟的植物鐵蛋白亞基N端位于蛋白殼的外表面具有一段特殊的延伸肽段（extension peptide，EP肽段）。重組大豆鐵蛋白4的晶體結構表明，EP肽段通過與殼表面相鄰亞基相互作用穩定植物鐵蛋白的整體結構。一方面，EP肽段具有二價亞鐵離子氧化能力；另一方面，EP肽段還具有絲氨酸蛋白酶活性，能夠調控鐵蛋白的自降解，也與鐵離子的還原釋放過程有關。不同于動物鐵蛋白疏水性四重軸通道，植物鐵蛋白的四重軸是由組氨酸組成的親水性通道，研究表明植物鐵蛋白的三重軸和四重軸親水通道均為鐵離子進出的主要通道。

細菌鐵蛋白（bacterioferritin，BFR）亞基結構與動植物鐵蛋白類似，且具有亞鐵氧化中心，但不同點在于細菌鐵蛋白是一種亞基均聚物。目前在原核生物中發現的鐵蛋白有3 類：第一類是與動物鐵蛋白的H亞基結構相似的典型鐵蛋白（canonical ferritin，FTN）；第二類是結合血紅素的BFR；第三類是DNA結合蛋白Dps。大多數FTN具有典型的正八面體4-3-2對稱結構，且具備鐵氧化還原中心。與FTN不同，結合血紅素的BFR包含12 個血紅素，通過亞基二聚體中間界面的兩個甲硫氨酸殘基與血紅素結合。研究表明，大腸桿菌和銅綠假單胞菌鐵蛋白中的血紅素雖然不是鐵氧化沉淀或籠狀組裝所必需，但對于鐵還原釋放有顯著作用。Dps蛋白又稱小鐵蛋白，由12 個亞基組成1 個2-3對稱的籠形結構，內徑約為4.5 nm，外徑約為9 nm。除此之外，科學家們也發現結構獨特的BFR：來自火焰色古生菌的鐵蛋白（ferritin，AfFtn）以一種獨特的方式組裝成呈四面體2-3對稱的籠狀結構，表面有4 個直徑約45 ?的大孔。AfFtn和海棲熱袍菌鐵蛋白在低離子強度下以亞基二聚體形式存在，通過添加特定的礦物離子可重新組裝為24聚體結構。

1.3 鐵蛋白的結構改造

由于天然蛋白質的尺寸和形狀比較單一，限制了其應用范圍。于是科學家們通過人工設計構建新型鐵蛋白納米籠。鐵蛋白分子4 種亞基間界面對鐵蛋白籠狀結構的形成非常重要，其中C-C界面的表面積最大，其次是C、C和C界面。Zhang Shengli等通過在C-C界面關鍵位置插入或者刪除氨基酸使24聚體鐵蛋白分別轉變為16聚體和48聚體籠形鐵蛋白（圖2A）。16聚體鐵蛋白由兩個相似的8聚體通過疏水作用連接在一起，形成扁球形中空結構。48聚體鐵蛋白的外徑則擴大為17 nm，其內部空腔容量大約是原來的4.3 倍，但在溶液條件下48聚體不穩定，會轉化為直徑約為10 nm的碗狀8聚體鐵蛋白。之后Zang Jiachen等以上述碗狀8聚體鐵蛋白為模板，通過設計鏈內二硫鍵和鏈間二硫鍵為作用力，分別成功將其轉化為3 種新型的籠形蛋白：籠形24聚體（外徑12 nm）、橢圓16聚體（長軸10 nm、短軸8 nm）以及籠形48聚體（外徑17 nm）（圖2B）。而當完全消除鐵蛋白的C-C界面，即刪除鐵蛋白亞基羧基端49 個殘基時，鐵蛋白將轉化為8聚體納米環狀結構（圖2C）。該納米環內壁僅由B螺旋組成，而其外壁由A螺旋、C螺旋和BC-環組成，其高度為5.1 nm，內外徑分別為3.2 nm和7 nm。

圖2 鐵蛋白的結構改造Fig. 2 Structural transformation of ferritin

除了重新設計界面作用力得到更多不同尺寸形狀的新型鐵蛋白外，對于鐵蛋白分子內組裝調控的研究也取得了成功。Huard等通過改造鐵蛋白C界面使得鐵蛋白的自組裝可以通過二價銅離子的結合來進行控制。而Gu Chunkai等通過將組氨酸結構域插入到鐵儲藏蛋白C界面處，成功制備得到一種新型4聚體鐵蛋白，鎳、銅以及鋅等過渡金屬離子在接近中性條件下可以誘導其重新自組裝成24聚體籠形蛋白，而加入螯合劑后籠形蛋白又可重新解離成4聚體，該研究也為鐵蛋白在中性條件下包埋生物活性物質提供了良好的應用模型。

2 鐵蛋白在食品營養領域的應用

2.1 礦質元素載體

鐵是生物體必需的微量元素之一，而缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA）則是世界范圍內最為普遍的一種營養素缺乏癥，嚴重影響著人類的營養與健康，其主要原因在于鐵攝入不足或過量消耗，因此科學家們在不斷探索高效且安全的補鐵制劑。目前，市場上常見的補鐵劑主要是以硫酸亞鐵或葡萄糖酸亞鐵為代表，該類補劑雖然鐵含量高、價格便宜，但性質不穩定且易受到食物其他組分的影響，同時會對人體產生一定副作用，如腹瀉、嘔吐、生長遲緩等。天然植物鐵蛋白特別是豆科類種子中的鐵蛋白，由于其廣泛來源以及豐富的鐵含量受到了科學家的關注，被認為是一種新型天然膳食的補鐵因子。得益于蛋白質外殼的保護，植物鐵蛋白的鐵不容易受到膳食中螯合劑如植酸和單寧酸的影響。在豆科類種子中，90%以上的鐵元素以鐵蛋白的形式貯存在淀粉質體中，研究者比較了大鼠對硫酸亞鐵與分離提取的大豆鐵蛋白的鐵吸收效果后發現，兩組之間沒有顯著性差異，故大豆鐵蛋白中的鐵能被人體很好地吸收，具有與硫酸亞鐵相似的補鐵功效。鐵蛋白可以抑制亞鐵離子自氧化生成具有毒副作用的活性氧， 具有去毒作用，蛋白可作為一種植物來源的新型補鐵制劑。

鈣是人體含量最為豐富的無機元素，參與體內多種生理過程，對人體的生長發育、營養健康起著重要作用。目前我國缺鈣現象仍然普遍，市場上補鈣制劑主要分為無機鈣、生物活性鈣、有機鈣以及氨基酸螯合鈣等，這些鈣制劑均存在一定的應用缺陷，隨后以多肽或蛋白質為主要配體的鈣制劑迅速發展，研究發現鈣或其他礦物元素可以通過肽轉運機制或蛋白質的特異性受體被小腸細胞所吸收。雖然乳制品是生物可利用鈣的良好來源，但不適合于素食主義者等人群，因此開發植物來源蛋白質為載體的補鈣制劑尤為重要。為解決上述問題，研究人員將鈣離子裝載進植物鐵蛋白空腔中，制備得到鐵蛋白鈣復合物。細胞吸收實驗發現，植物鐵蛋白能夠保護鈣離子不受膳食抑制因子如草酸、單寧酸的干擾。此外，與已知的二價金屬離子轉運蛋白1（divalent metal-ion transporter-1，DMT1）介導的二價金屬離子吸收途徑不同，細胞可通過新的TfR1參與途徑吸收鐵蛋白-鈣復合物，故鐵蛋白包裹的鈣離子不會干擾其他二價金屬離子的吸收。隨后，鋅、銅、硒等多種礦物元素被裝載到鐵蛋白空腔已得到實驗驗證，其特殊的中空結構和籠形的蛋白質外殼可以克服金屬離子溶解度低以及易受外界環境干擾的缺點，顯著提高礦質元素的生物利用率。綜上所述，鐵蛋白作為礦質營養元素載體具有廣闊的應用前景。

2.2 活性營養物質包埋

食品中存在著許多高生物活性小分子，如-胡蘿卜素、姜黃素、蘆丁、花青素、葉黃素、原花青素等，這些物質被認為具有抗氧化、抗癌和抗炎癥等生物活性，對于人體健康具有較大促進功能。然而這些化合物大多對于環境條件十分敏感，如水不溶性或光、熱不穩定性等，這極大限制了其在營養和人類健康領域的應用，因此克服這些限制因素顯得至關重要。近年來，動植物鐵蛋白在食品科學和營養健康領域受到廣泛關注，科學家們利用鐵蛋白受pH值控制的可逆解離組裝特性來包埋各種水溶性或脂溶性活性營養素。這一方法簡單易行且環境友好，同時研究發現包埋后營養小分子的水溶性、光熱穩定性和細胞攝取活性明顯優于游離狀態，鐵蛋白分子同時還能防止包埋物質受到食品中其他成分的干擾。

2.2.1 水溶性活性物質包埋

花青素屬于類黃酮類物質，是一種重要的水溶性植物色素，水果、蔬菜等豐富的色彩大部分與之有關。花青素是一種強抗氧化劑，能夠保護人體免受自由基的損傷，還能夠增強血管彈性、抑制炎癥和過敏，在食品中不但可作為營養強化劑，而且還可作為著色劑應用于飲料產品中。然而在商品加工和貯存過程中，溫度、氧氣、光和酶等因素嚴重影響著花青素的穩定性，通過與各種有機酸酰基化、自締合等方法雖然可以達到穩定花青素的作用，然而對花青素的保護仍非常有限。矢車菊素-3--葡萄糖苷（cyanidin-3--glucoside，C3G）是桑椹花青素的主要成分之一，利用pH值介導鐵蛋白解離重組的方法可以將C3G包裹在重組大豆鐵蛋白的空腔內，研究結果顯示平均1 個鐵蛋白內部空腔可以裝載約37.5 個C3G分子，包埋后C3G分子的熱穩定性和光穩定性提高了約2 倍。更重要的是，將C3G分子包埋在鐵蛋白空腔中可以顯著提高C3G的小腸吸收效率。

原花青素屬于多酚類物質，廣泛存在于各種植物中，其中以葡萄籽中原花青素含量最為豐富，提取率可達到9.5%。作為一種國際公認的抗氧化劑，原花青素還具有降血脂、降血糖、抗病毒、抗腫瘤等生物活性，故被廣泛應用于食品、保健品和藥品等領域。由于其酚羥基的結構在加工和貯存過程中容易受到溫度、氧氣和光照的影響，且在胃腸道運輸中原花青素可能會發生降解從而降低其生物利用率，這些因素嚴重限制了原花青素在食品與醫藥行業上的應用。利用鐵蛋白pH值介導的可逆組裝特性，原花青素被成功裝載于鐵蛋白空腔中，包埋率為23.2%，并且與游離的原花青素相比，原花青素在鐵蛋白納米籠中的光和熱穩定性顯著提高。體外消化實驗表明鐵蛋白納米籠能延長原花青素在胃腸道的釋放時間。

2.2.2 脂溶性活性物質包埋

姜黃素是從植物姜黃的根莖中分離出的活性成分，具有防腐和抗氧化作用。作為天然著色劑，姜黃素不會產生毒副作用且可以預防和治療多種炎癥疾病以及具備潛在的抗癌功能。但是姜黃素生物利用率低，水溶性差，溫度、pH值、光照、氧氣等外界因素都會影響其穩定性進而降低活性。研究人員利用鐵蛋白在不同pH值條件下的可逆組裝特性，將其包埋于人重鏈鐵蛋白內部空腔中，平均1 個鐵蛋白分子可以裝載約14.7 個姜黃素分子，包埋率和裝載率分別為14.7%和1.07%。經鐵蛋白包埋后姜黃素的水溶性從11 ng/mL增加到5 415 ng/mL，光熱穩定性測定結果表明姜黃素的降解抑制率可達64.99%～69.10%。研究認為鐵蛋白包埋生物活性營養分子實現穩定性的顯著提高得益于鐵蛋白的性質，一方面來自于鐵蛋白外殼的物理和化學的雙重保護作用，鐵蛋白具有良好的熱穩定性，其籠狀結構作為物理壁壘不僅隔絕了溫度，還能夠減少營養物質與外部的氧化劑分子相互作用，鐵蛋白的半胱氨酸殘基和其他官能團作為潛在的抗氧化劑還能夠提供化學保護作用。另一方面是鐵蛋白內部空腔可以通過疏水作用、范德華力或氫鍵等弱相互作用與營養物質形成復合物，有助于營養物質負載于內部空腔的穩定性。

葉黃素屬于類胡蘿卜素家族，是一種重要的天然植物色素，在蔬菜水果中廣泛存在。葉黃素安全無毒、提取方便，且在保護視力、預防心腦血管疾病、抑制腫瘤生長方面發揮著重要作用，在食品和醫藥領域具有廣闊的應用前景。葉黃素的穩定性很差，主要易受氧氣、光照、加熱、pH值等因素的影響，如熱處理過程可引起葉黃素產生異構化，此外水不溶性、生物利用度低等性質也嚴重限制了其實際應用。研究人員以大豆鐵蛋白和殼聚糖為材料，通過鐵蛋白受pH值控制的可逆解離重組特性和鐵蛋白與殼聚糖的相互作用，制備出一種殼聚糖-大豆鐵蛋白-葉黃素的復合材料。包埋結果顯示每個鐵蛋白包埋約25.2 個葉黃素分子，包埋率和裝載率分別為16.8%和2.50%，與游離葉黃素相比，復合物的光、熱穩定性均有較大提高。此外，由于鐵蛋白的包埋和與殼聚糖的結合，復合物在模擬胃腸道消化過程中葉黃素的釋放時間延長。同時研究發現食物成分對葉黃素的釋放有不同的影響，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、葡萄籽原花青素和牛奶對葉黃素的釋放有抑制作用，而果膠對葉黃素的釋放有促進作用。

2.2.3 鐵蛋白包埋策略的改良

以上結果表明，鐵蛋白作為一種納米載體在脂溶性以及水溶性活性營養成分包埋與遞送具有廣闊應用前景。然而，天然蛋白納米籠對營養物質分子的包埋存在以下缺陷：一是傳統的酸堿、變性劑促使解離重組的包埋方法（pH值低于2.0或高于12.0、8.0 mol/L尿素處理）會對鐵蛋白分子造成一定的損傷，一部分蛋白質無法重新組裝成完整的籠狀結構；二是包埋的條件可能無法維持活性營養物質的穩定性，從而影響包埋物質的生物活性。針對上述不足，科學家們開始研究探索不同的處理方法，使鐵蛋白分子能在較為溫和的實驗條件下進行活性物質的包埋。目前為止，各種改進的包埋策略已經實現，可以總結為3 類：第一類是通過物理處理或定向改造鐵蛋白納米籠使其能在pH值更為溫和的條件下解離（圖3A）；第二類是不破壞蛋白的籠狀結構，通過改變通道特性將營養物質包埋進鐵蛋白空腔之中（圖3B）；第三類則是制備能在中性pH值條件下存在的鐵蛋白低聚體，利用外部刺激等誘導蛋白質自組裝成籠形結構應用于活性物質包埋（圖3C）。下面具體介紹各種包埋改進策略。

圖3 通過不同策略改良鐵蛋白對營養物質的包埋Fig. 3 Improved strategies for molecule encapsulation within ferritin cavity

鐵蛋白作為納米載體在不同領域的應用如圖4所示。Chen Hai等通過刪除人鐵蛋白（human ferritin，HFn）DE轉角和E螺旋位置的氨基酸制備鐵蛋白突變體，該突變體在pH 4.0時就能實現亞基解離，在pH值調回中性時重新組裝。利用這種pH值較為溫和的解離條件同樣可將姜黃素分子包埋進內部空腔中，姜黃素的水溶性得到了極大提高（圖4A）。但刪除參與四重軸作用的這些氨基酸使得四重軸通道直徑擴大至1.8 nm左右，通道的擴大可能會引起較小包埋物質的泄漏。Wang Wenming等則通過刪除鐵蛋白C-C界面AB環中的若干氨基酸，同樣得到了可在較為溫和pH值條件下可逆自組裝的鐵蛋白突變體，成功將姜黃素等活性物質包埋于空腔中，而且該突變體不會產生可能引起包埋物質泄漏的大孔道。此外，通過一些物理方法對鐵蛋白進行處理，同樣可以將其應用于溫和條件下營養物質的包埋。研究發現大氣壓冷等離子體、脈沖電場、壓熱超聲處理等加工技術處理后的鐵蛋白比未處理的鐵蛋白能在pH值更為溫和的條件下解離成單亞基，并在中性環境下重新自組裝成納米籠結構，利用這種方法成功將姜黃素、蘆丁、EGCG等活性營養物質包埋于鐵蛋白納米籠中。

Yang Rui等研究發現低濃度尿素（20 mmol/L）處理會將植物鐵蛋白的通道直徑擴大4 倍左右，營養小分子如EGCG可以通過擴大的通道進入鐵蛋白空腔，而不需要破壞鐵蛋白的籠狀結構。透析去除尿素分子后，通道恢復正常大小，營養小分子則被包埋在鐵蛋白納米籠中，包埋率可達17.6%。由于鐵蛋白通道處氨基酸相互作用對于變性劑分子的敏感性，低濃度（2 mmol/L）的鹽酸胍也可用來制備鐵蛋白活性分子包埋復合物。此外，研究發現60 ℃熱處理可以通過展開周圍的-螺旋來擴大植物鐵蛋白的四重軸通道，活性分子蘆丁可在pH值為中性的條件下通過通道進入空腔。當溫度降低到20 ℃時，蘆丁被封裝在鐵蛋白空腔內。利用此方法，平均1 個鐵蛋白分子可包埋約10.5 個蘆丁分子，包埋率為8.08%。張晨曦等則利用超聲輔助加熱的方法處理鐵蛋白，蝦青素可通過擴大的鐵蛋白通道進入內部空腔之中，包埋率為19.8%。溫和的包埋處理不會嚴重破壞蝦青素等營養物質的生物活性，且蝦青素的水溶性和光熱穩定性均可得到顯著改善。與游離的蝦青素相比，鐵蛋白-蝦青素復合物能顯著抑制HO誘導的HepG2細胞的氧化應激損傷。

前面提到的人工改造的鐵蛋白在活性物質包埋方面也表現出顯著優勢。以16聚體新型蛋白籠為載體可在pH值為3.0的條件解離從而包埋姜黃素，姜黃素的溶解度可提高至游離狀態的458 倍。在鐵蛋白C界面引入組氨酸結構域，使其在中性pH值條件下以四聚體的形式存在，在過渡金屬離子或pH值等外部刺激下可實現蛋白自組裝成鐵蛋白籠狀結構。將這種組氨酸介導的可逆蛋白自組裝特性應用于姜黃素等活性物質包埋，其效率幾乎是已報道的酸堿變性包埋方法的3 倍，這極大地拓寬了鐵蛋白在活性物質包埋遞送的應用前景。

2.3 重金屬檢測

圖4 鐵蛋白作為納米載體在食品營養、醫藥、診斷等領域的應用Fig. 4 Application of ferritin as nanocarrier in food nutrition, medicine and diagnosis

汞是一種劇毒重金屬，其可通過食物鏈進行生物累積從而嚴重威脅著人體健康。汞化合物可以分為無機汞和有機汞。無機汞主要以二價汞離子（Hg）形式存在于環境中，攝入或吸入會對人神經、胃腸道系統以及內臟器官等產生嚴重危害，因此建立能快速準確檢測汞離子的方法對于食品安全、人類健康以及環境檢測等方面具有重要意義。目前，原子吸收光譜、原子發生光譜、電感耦合等離子體質譜、電化學法等儀器方法可用于檢測Hg等重金屬離子，但這些傳統方法存在成本高、處理過程繁瑣等應用缺陷。近年來，熒光探針檢測技術由于其靈敏度高、選擇性好、應用方便等優勢逐漸受到了研究人員的廣泛關注。Wang Yingjie等通過在HFn納米籠外表面連接一段MBP，成功制備了一種對Hg具有高結合能力的蛋白納米籠（HFn-MBP）。用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的HFn-MBP的熒光可以被GO猝滅，而在上述體系中加入Hg可以以劑量依賴的方式恢復被猝滅的熒光（圖4B）。該傳感器由FITC標記的HFn-MBP和GO組成，對Hg具有較高的靈敏度和選擇性，檢測限可達1.0 nmol/L。此研究為鐵蛋白納米籠在重金屬離子檢測中的應用開辟了新的途徑。

一般來說，有機汞化合物的毒性要遠高于無機汞，而在有機汞中，甲基汞（methylmercury，MeHg）危害性最大。由于分子質量小，脂肪溶解性強，故MeHg容易通過血腦屏障，具有較強的神經毒性。金納米團簇因其獨特的熒光特性和優良的化學穩定性在化學傳感和生物成像領域得到了廣泛的應用，同時也被用于汞化合物檢測等探針開發。Lü Chenyan等利用非天然的16聚體鐵蛋白作為生物模板，在水環境中以簡便綠色的方法制備了一種新型16聚體鐵蛋白-金納米簇（7A-Au NCs），所制備的鐵蛋白-金納米簇復合物可在體內和體外高選擇性地檢測Hg和MeHg，其不僅適用于血腦屏障內皮細胞的生物成像，而且可作為一種腦特異性MeHg生物成像的有效探針。由此可見，以鐵蛋白為模板制備的納米材料在食品安全及醫學領域的重金屬離子檢測方面具有很大的前景。

3 鐵蛋白在生物醫藥領域的應用

3.1 抗癌藥物遞送

惡性腫瘤是全球范圍的健康問題，據國際癌癥研究機構統計，2008—2018年全球癌癥死亡病例增加了26.3%。持續增長的癌癥死亡率提示著腫瘤治療仍存在著巨大的挑戰，除了各種抗癌藥物的研發，對于納米藥物載體的研究同樣引起了廣泛的關注。由于人重鏈鐵蛋白可以特異識別TfR1，通過冷凍電子顯微鏡技術對TfR1與人重鏈鐵蛋白的復合物結構解析發現，H型亞基A螺旋的氨基端、BC-環和C螺旋的羧基端是鐵蛋白與TfR1結合的相應區域。TfR1在腫瘤細胞中過表達，利用其固有的腫瘤靶向性，人重鏈鐵蛋白已被廣泛用于裝載順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等鉑類化合物、Dox、金基化合物（Au2phen和Auoxo4）、釕絡合物（DiRu-1）等多種抗癌藥物。研究發現鐵蛋白作為藥物載體能夠穿越血腦屏障，實現對原位惡性腦膠質瘤的靶向治療（圖4C）。血腦屏障是維持中樞神經系統穩態和保護腦組織免受代謝物損傷的天然屏障，幾乎所有大分子藥物和大部分小分子藥物無法穿越血腦屏障抵達腦組織，故中樞神經系統疾病如惡性腦瘤無法得到有效治療。由于TfR1在腦內皮細胞和惡性腫瘤細胞中均能高表達，實驗結果表明鐵蛋白可通過腦內皮細胞的轉胞吞作用穿過血腦屏障且不會阻斷在溶酶體，又可以通過TfR1介導特異性富集到惡性腦瘤細胞的溶酶體中降解。鐵蛋白包埋并靶向釋放藥物Dox從而靶向殺傷癌細胞。鐵蛋白與TfR1特異性的靶向結合及理想的納米尺寸效應是其既可以穿越血腦屏障又具有腫瘤組織高選擇性的重要原因。

在其他鐵蛋白外表面進行基因修飾同樣可以賦予其癌細胞靶向性，de Turris等在AfFtn表面設計一段序列來模擬人重鏈鐵蛋白，突變體保留了AfFtn能夠在中性pH值條件下由礦物離子控制的解離組裝特性，同時能通過TfR1受體識別并被HeLa細胞內吞。Jiang Bing等在激烈火球菌鐵蛋白表面修飾肝癌細胞靶向肽SP94使其能夠特異結合肝癌細胞表面的受體葡萄糖調節蛋白78，當內腔裝載Dox時，鐵蛋白藥物能夠精準殺傷肝癌細胞。當內部空腔裝載CoO納米酶時，利用納米酶的過氧化物酶活性，鐵蛋白探針可催化過氧化物酶底物，使肝癌細胞可視化。同時該課題組研究發現藥物分子進入人重鏈鐵蛋白的通道是位于鐵蛋白二重對稱軸處的柔性區域，通道的大小可受溫度調控。溫度升高有助于周圍的氨基酸殘基擺動到遠離二重軸的位置，藥物從此處進入鐵蛋白內腔。基于這一發現可以通過溫度調節的方法將Dox、鉑類等抗癌藥物裝載到鐵蛋白內腔。

3.2 診斷及光熱治療

鐵蛋白空腔的生物礦化能力以及表面易于修飾的特性使得鐵蛋白成為了良好的生物成像設備，其在核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和PAI中得到了廣泛的應用。MRI是一種強大的診斷技術，由于其高靈敏度和準確性，被廣泛用于腫瘤成像。然而，目前使用的釓基造影劑缺乏對癌細胞的特異性導致假陽性出現，同時MRI由于空間分辨率不夠可能無法檢測到隱匿的腫瘤微沉積。Cao Changqian等通過在鐵蛋白納米籠內合成磁鐵礦核作為MRI造影劑用于癌癥的體內檢測，其具備極高的造影性能和TfR1依賴的MRI信號。Wang Zhantong等利用仿生合成的方法在鐵蛋白空腔內合成了硫化銅納米顆粒（圖4D），CuS-Fn NCs具有極靈敏的腫瘤特異性靶向效應，在放射性核素Cu標記后可利用PET及PAI兩種成像模式表征腫瘤。同時，該材料具有較強的近紅外吸收光熱轉化效率，靶向癌細胞后利用較低的激光照射便可達到高效的腫瘤PTT效果，可實現多模態成像指導的PTT。綜上所述，諸多研究表明鐵蛋白納米籠是一種極具前景的腫瘤成像和PTT的納米載體。

4 結 語

由于鐵蛋白具有單分散性、高溶解性、高生物安全性和高穩定性等優點，利用鐵蛋白納米籠狀結構、解離自組裝以及易于修飾的特性將活性物質或抗癌藥物進行包埋和靶向遞送具有重要的意義。經過鐵蛋白包埋后，活性營養物質的水溶性、熱穩定性、光穩定性和細胞攝取率均得到顯著提高，藥物分子能夠精準地靶向殺傷腫瘤細胞，且能夠穿越血腦屏障抵達腦組織。諸多研究表明鐵蛋白可作為一種新的包埋生物活性物質的納米載體。此外，在食品重金屬檢測以及活體成像診斷等方面，鐵蛋白納米載體也具有非常廣闊的應用前景。盡管針對鐵蛋白包埋物質的制備方法和應用已經取得了很大的進展，但仍存在一些問題需要解決。首先，鐵蛋白的包埋效率以及裝載能力仍需提高，通過人工設計更多不同形狀和性質的新型鐵蛋白納米籠或制備蛋白組裝體利用組裝間隙的空間是可能的解決方案，但具體的應用體系需深入探索。其次，目前研究大多集中在鐵蛋白包埋物質的制備方法和醫藥應用，鐵蛋白納米載體在食品營養與檢測方面的應用應受到更多關注。最后，鐵蛋白在胃中的穩定性以及客體分子的細胞攝取效率有待進一步提高，這樣才能保證鐵蛋白運載體系對人體營養與健康的貢獻進入實際臨床應用。