乳酸克魯維酵母作為微生物細胞工廠的應用研究進展

劉士琦，榮蘭新，趙栢祥，盧志慧，趙 禹，肖冬光，于愛群,2,*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457）

合成生物學是一門綜合了生物學、化學、物理學和工程學等學科知識的新興前沿交叉學科。近年來，合成生物學理論和技術的迅猛發展也對生命科學基礎研究和工業生物技術產生了深遠影響，尤其是在構建微生物細胞工廠生物合成生物燃料、平臺化學品、復雜大分子等各種高附加值產品方面展現出了巨大的應用前景和賦能潛力。合成生物學的發展正在為醫藥、化工、食品、能源、材料、農業等各個工業領域帶來深刻變革，也必定對人類社會發展產生廣泛和深刻的影響。其中，酵母菌屬于單細胞低等真核生物，它兼有原核生物和真核生物兩者的優點，因此被認為是合成生物學研究最理想的模式生物之一。

乳酸克魯維酵母最早是從牛奶中分離得到的一種非常規酵母菌。對該酵母的遺傳學研究開始于20世紀60年代初，起初其被歸為酵母屬，被命名為。但后來發現該酵母不能與釀酒酵母（）進行雜交，又將其歸為克魯維酵母屬；再后來其又被更名為馬克思克魯維酵母乳酸變種（var.）。直到20世紀90年代，以分子生物學為基礎的分類方法確定了該酵母與馬克思克魯維酵母實際上是兩個獨立的物種，并最終將其命名為乳酸克魯維酵母（）。

乳酸克魯維酵母細胞呈球形或橢圓形，細胞體積略小于釀酒酵母細胞，主要進行多邊芽殖，不產生子囊孢子和假菌絲；菌落呈乳白色，表面光滑、隆起，邊緣整齊，無褶皺，略有光澤，質地細膩有黏性。與釀酒酵母不同，乳酸克魯維酵母屬于嚴格好氧菌，其可利用的碳源范圍也更為廣泛，包括葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、乙醇、甘露醇、乳酸、琥珀酸、檸檬酸等，特別是由于其能夠產生-半乳糖苷酶和乳糖透性酶分解乳糖，因此，能夠在以乳糖為唯一碳源的培養基中生長。乳酸克魯維酵母與釀酒酵母之間既有相似之處，又有不同之處。表1主要從傳代方式及能量代謝等方面比較了這兩種酵母的異同，其中這兩者較為明顯的差異是釀酒酵母在有氧條件下也會受到克雷布特效應的影響，而乳酸克魯維酵母不存在該效應，因而在發酵過程中更易獲得較高的菌體生物量。此外，乳酸克魯維酵母底盤細胞作為異源表達宿主還具有諸多優勢：第一，它已被美國食品藥品監督管理局認證為食品安全級（generally recognized as safe，GRAS）微生物；第二，其遺傳背景清晰，易于進行遺傳操作，且基因游離表達和整合表達的穩定性均較高；第三，其蛋白分泌能力強、糖基化適度；第四，其可以在標準酵母培養基中生長，大規模發酵時不需要甲基營養型酵母（例如巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母）所需的防爆發酵設備。自20世紀50年代以來，乳酸克魯維酵母一直被用作-半乳糖苷酶（俗稱乳糖酶，可降解乳糖，是無乳糖乳制品生產所必需的酶）的工業生產菌株。從20世紀60年代開始，干燥失活的乳酸克魯維酵母一直被用作食品補充劑。因此乳酸克魯維酵母在食品發酵工業中具有重要的研究意義和廣闊的應用前景。

表1 乳酸克魯維酵母與釀酒酵母主要特征的對比Table 1 Comparison of key features of K. lactis with those of the model yeast S. cerevisiae

近年來，以乳酸克魯維酵母為底盤細胞開展的一系列合成生物學方面的基礎及應用研究發展迅速，并逐漸成為研究熱點。本文主要對乳酸克魯維酵母底盤細胞在合成生物學元件、遺傳操作工具、基因編輯策略等方面的研究進展進行了介紹，并對利用合成生物學手段構建乳酸克魯維酵母細胞工廠的應用研究進展進行了綜述和展望。

1 乳酸克魯維酵母的分子遺傳學及合成生物學研究進展

1.1 合成生物學元件

以已知的代謝網絡和重組DNA技術為基礎，采用自下而上的理念，通過設計一些合成生物學功能元件以精確調控代謝途徑，改善微生物底盤細胞性能，從而實現目的產物的高效合成是合成生物學的重要研究內容之一。近年來，研究人員已經在乳酸克魯維酵母底盤中構建了能夠穩定表達的載體（整合型質粒和游離型質粒），并對啟動子、終止子和信號序列等常用（合成）生物學功能元件進行了優化，從而大大提升了乳酸克魯維酵母作為微生物細胞工廠的潛力。本節主要總結乳酸克魯維酵母底盤中常用的合成生物學元件以及分子遺傳學方面的研究進展。

1.1.1 啟動子

通過控制啟動子的強度可以有效改變基因表達水平。高效的強啟動子通常會對外源基因表達產生很強的促進作用，因此構建和篩選強啟動子是提高乳酸克魯維酵母底盤中外源產物產量和得率的有效策略。

目前，雖然有一些乳酸克魯維酵母的組成型和誘導型啟動子已經得到了功能鑒定，但總地來說，已報道的可用于異源基因表達的高效啟動子數目仍然較少。其中，-半乳糖苷酶基因（）的啟動子P是目前在乳酸克魯維酵母底盤中應用最廣泛的內源強啟動子，該啟動子可由乳糖或半乳糖誘導（圖1）。在乳酸克魯維酵母細胞內，轉錄激活因子Lac9對P具有激活作用，而Lac9又受到抑制劑KlGal80和雙功能蛋白KlGal1的調控。當細胞內乳糖水解或吸收胞外半乳糖時，KlGal1開始發揮作用，催化半乳糖轉化為半乳糖-1-磷酸；同時KlGal1與KlGal80結合并使其失活，從而進一步誘導Lac9的表達，最終實現了對基因的誘導表達。

圖1 乳酸克魯維酵母β-半乳糖苷酶基因啟動子PKlLAC4的轉錄調控機制Fig. 1 Mechanism for the transcriptional regulation of the promoter of the β-galactosidase gene in K. lactis

此外，在乳酸克魯維酵母底盤中應用較多的其他一些啟動子還包括來自釀酒酵母的組成型啟動子P，乳酸克魯維酵母內源誘導型啟動子P、P和P等。P是釀酒酵母中磷酸甘油酸激酶基因（）的啟動子，也是釀酒酵母中具有較高活性的啟動子之一，目前已被成功應用于乳酸克魯維酵母生產白細胞介素-1β和嗜熱酯酶等。P是乳酸克魯維酵母酸性磷酸酯酶基因（）的啟動子，它受到胞內無機磷酸鹽濃度的調節；磷酸鹽濃度低對乳酸克魯維酵母酸性磷酸酯酶的合成具有較明顯的促進作用，目前該啟動子也已被應用于乳酸克魯維酵母生產白細胞介素-1β和-淀粉酶。編碼乳酸克魯維酵母線粒體乙醇脫氫酶基因（）的啟動子P是乙醇誘導型啟動子，且該啟動子并不受葡萄糖的抑制，已被用于人血清白蛋白、--阿拉伯呋喃糖苷酶和超氧化物歧化酶等多種蛋白在乳酸克魯維酵母底盤中的生產。P是乳酸克魯維酵母中編碼丙酮酸脫羧酶基因（）的啟動子，其活性受到碳源和溶氧水平的調控，已被用于乳酸克魯維酵母異源生產來自毛栓菌（）的漆酶和來自一種耐鹽酵母菌（）的葡萄糖淀粉酶等。天然啟動子的使用大大提高了蛋白及其他高值產物的表達水平，除了這些天然存在的內源和外源啟動子，人工合成啟動子也已被證明是微生物細胞工廠中非常具有發展潛力的合成生物學元件之一。例如，Sakhtah等通過將組成型啟動子P和碳源敏感型啟動子P的部分區域在體外進行雜合，構建出了受碳源精確調控的人工雜合啟動子P，當培養基中存在葡萄糖和甘油等碳源時，該啟動子的功能被抑制；當培養基中的碳源被耗盡時，該啟動子就被激活并啟動目的基因的表達。該研究構建的受碳源精確調控的人工啟動子對于進一步闡明酵母啟動子的作用機制具有十分重要的意義。隨著釀酒酵母和解脂耶氏酵母等酵母人工合成啟動子研究的不斷深入，勢必會促進乳酸克魯維酵母人工合成啟動子的快速發展。

乳酸克魯維酵母底盤中異源表達目標基因中常用的啟動子如表2所示。

表2 乳酸克魯維酵母底盤中異源表達目標基因中常用的啟動子Table 2 Most commonly used promoters for heterologous expression of target genes in K. lactis

1.1.2 終止子

相比于啟動子，終止子對于基因轉錄水平和mRNA穩定性的影響經常被低估。但實際上，在酵母菌等真核生物中，終止子既能夠在轉錄水平上調控基因的表達，又能夠影響轉錄后mRNA的穩定性，因此它也是非常重要的合成生物學元件。

在釀酒酵母中，最常用的終止子包括t和t，但這兩個終止子的序列較長，不利于多基因表達載體的構建。為了解決這一問題，Curran等開始構建一系列短的、人工合成的終止子，相比于釀酒酵母的t，這些人工終止子中蛋白熒光強度和mRNA表達量最高分別增加了3.7 倍和4.4 倍；此外，Curran等還將基于釀酒酵母的人工合成終止子在解脂耶氏酵母中進行了功能驗證，結果發現該合成終止子有很好的種間可轉移性。乳酸克魯維酵母表達系統經常使用的終止子是其內源的t和來自釀酒酵母的終止子如t、t和t等。然而到目前為止，還沒有關于乳酸克魯維酵母人工終止子基因工程的報道，在釀酒酵母底盤中得到功能驗證的人工合成終止子也并未在乳酸克魯維酵母底盤中得到應用，但是在釀酒酵母和解脂耶氏酵母中可以進行功能轉移人工合成終止子的研究為異源合成終止子在乳酸克魯維酵母中的應用開拓了思路。因此，利用合成生物學技術來開發乳酸克魯維酵母適用的性能穩定、功能可控的人工合成終止子可以成為未來乳酸克魯維酵母分子遺傳學和合成生物學研究的重點分支方向之一。

1.1.3 信號序列

信號序列是一段疏水氨基末端的延伸，具有引導多肽鏈進入內質網腔的功能，也是酵母底盤中調控基因表達和蛋白質分泌所必不可少的生物學元件。通常情況下，蛋白質在細胞質中的積累量遠遠大于其在培養基中的積累量，這使得下游加工過程中需要額外引入復雜的蛋白質純化工藝。相對而言，胞外分泌的蛋白質純化過程會更簡單、高效，更利于大規模工業化生產。因此，合適信號序列的選擇是酵母底盤細胞高效合成內源/外源蛋白質的重要環節。酵母細胞中負責分泌特定蛋白的信號序列通常包含一個位于信號序列和異源蛋白之間的C末端Kex2蛋白酶識別位點，因此，一旦新產生的多肽進入內質網，信號序列就被切除。真核生物信號序列之間的保守性非常強，而且一般情況下，天然存在的信號序列就能夠滿足對外源蛋白進行有效分泌的要求。

到目前為止，一些內源、外源和合成的信號序列已經被成功應用到乳酸克魯維酵母表達系統中以合成各種具有不同分泌需求的外源蛋白質。比如，Fleer和Berg等分別以人血清白蛋白和凝乳酶為模型蛋白，比較了乳酸克魯維酵母中不同分泌信號的作用效果。Madhavan等將里氏木霉（）的外切纖維素酶I基因（）的分泌信號與P啟動子融合，在乳酸克魯維酵母中進行重組蛋白的表達，并與來自釀酒酵母的-交配因子（-mating factor，-MF）信號肽進行功能比較，結果表明分泌信號更能顯著提高重組蛋白在乳酸克魯維酵母底盤中的表達量。上述研究結果表明不同的分泌信號對蛋白的胞外分泌影響十分明顯，因此需要開發具有普適性、效率高的分泌信號序列，為異源蛋白的高效表達提供穩定可靠的解決方案。

1.1.4 選擇標記

目前，在乳酸克魯維酵母遺傳操作系統中，通常是選擇營養缺陷型和藥物抗性來作為篩選標記。其中，抗性標記能夠在包括原養型菌株在內的任何菌株中使用，而G418和博來霉素這兩種真菌抗生素的應用更為廣泛。營養缺陷型標記只能應用于特定的菌株，而、、也已經被證明是篩選乳酸克魯維酵母陽性轉化子的理想標記。此外，氮源篩選標記的利用也是在乳酸克魯維酵母中重要的特異性篩選方案。該篩選標記是以構巢曲霉（）中的乙酰胺酶（由基因編碼）為基礎形成的，乙酰胺酶可以將乙酰胺分解生成含氮化合物，供菌株生長。當其作為篩選標記時，乙酰胺就是培養基中的唯一氮源，只有成功轉化含有乙酰胺酶標記的陽性菌株才能在該篩選培養基上生長。該方案已經被應用于乳酸克魯維酵母商用菌株GG799中，并成功實現了對牛腸激酶、纖維素酶等多種蛋白的異源表達。乙酰胺酶還可以分解氟乙酰胺，生成對細胞有毒害作用的物質，使含有乙酰胺酶標記的菌株不能生長，因此利用這一原理還可以實現該篩選標記的回收和重復利用。

1.1.5 質粒載體

外源基因在酵母中的表達主要有兩種策略：游離型質粒表達和整合型質粒表達。游離型質?；蚓哂锌截悢递^高的優點，但是在沒有選擇標記的情況下容易發生丟失；整合型質粒具有能夠在細胞中較穩定表達的優點，但基因拷貝數通常較低。

目前，最常用的乳酸克魯維酵母整合型質粒是由美國NEB公司生產的商用載體pKLAC1和pKLAC2，該系列載體含有突變的Pribnow序列（PBI）、乳酸克魯維酵母內源基因終止子t、由釀酒酵母啟動子P調控的黑曲霉乙酰胺酶基因（）的選擇標記基因、氨芐西林抗性基因（）和大腸桿菌復制起點（ori）。

目前在乳酸克魯維酵母中可用的游離型質粒大多是以天然質粒為基礎構建形成的。其中，從果蠅克魯維酵母變種中分離得到的pKD1質粒在乳酸克魯維酵母中的應用較為廣泛。該質粒的特征與釀酒酵母的2 μm質粒較為相似，包含一個果蠅克魯維酵母的復制起點、編碼位點特異性質粒重組酶的基因A、參與分配的基因B和C、順式作用分配位點和反向重復序列的重組酶位點。

嗜殺質粒pGKLl和pGKL2是一種線性雙鏈DNA質粒，天然存在于多個克魯維酵母菌株中。它們能夠在細胞質中穩定存在，且拷貝數較高（每個細胞中可達100～200 個拷貝），也能夠產生異源三聚體內毒素。嗜殺質粒作為乳酸克魯維酵母的表達載體時存在兩個明顯缺陷：第一，嗜殺質粒的5′端通常含有共價連接蛋白，這使得體外操作更加復雜，并阻礙了其在大腸桿菌中的擴增；第二，嗜殺質粒中目的基因的表達通常需要特定的轉錄信號，Kamper等通過將外源基因與pGKL1中ORF2的啟動子和終止子融合構建表達盒的方法較為理想地解決了該問題。

1.2 基因編輯策略

在代謝工程和合成生物學改造過程中，通常會涉及到多基因的遺傳修飾。因此，高效的基因編輯技術是代謝工程和合成生物學的基本工具。隨著各種高效、精準的基因編輯技術在乳酸克魯維酵母底盤中的成功應用，極大推動了關于乳酸克魯維酵母代謝工程和合成生物學研究的快速發展。本節對傳統的基因定點靶向整合技術以及應用前景較好的CRISPR-Cas技術在乳酸克魯維酵母底盤中的應用情況進行綜述。

1.2.1 基因定點靶向整合技術

外源DNA片段整合到微生物底盤細胞的基因組中需要借助其雙鏈斷裂（double strand break，DSB）修復機制。目前，在真核細胞中主要有同源重組和非同源末端連接兩種修復機制。同源重組整合外源基因主要依賴于基因簇，包括、、、、和等基因，可以實現外源基因在底盤細胞基因組的精確定點整合；而介導非同源末端連接的基因主要包括、、（哺乳動物中）、和等，這可能會造成異源基因的表達盒或線性化質粒隨機連接到底盤細胞基因組的不同位置上。在釀酒酵母細胞中，外源基因的整合更偏向于利用同源重組的修復方式，而乳酸克魯維酵母的DNA修復偏好性則與釀酒酵母完全不同，非同源末端連接是外源DNA整合到其基因組上的最常見方式。例如，在野生型乳酸克魯維酵母中，外源基因的同源臂長度為50 bp時的整合效率為0%，當同源臂長度增加到600 bp時，整合效率提高到88%；但是，構建過長同源臂往往費時費力，為了實現乳酸克魯維酵母細胞工廠的快速構建，敲除介導異源基因非同源末端連接的基因可以提高乳酸克魯維酵母異源基因定點整合的效率。目前，乳酸克魯維酵母基因組中常用的定點整合位點是位點，NEB公司針對該位點設計了經典的整合型質粒pKLAC1和pKLAC2，并一直沿用至今。使用該系列質粒時，應首先利用限制性內切酶II對該質粒進行線性化，隨后P啟動子的5’端和3’端可分別作為上下游同源臂與乳酸克魯維酵母基因組上的位點進行同源重組，從而實現外源基因在乳酸克魯維酵母基因組上的高效定點靶向整合。具體過程如圖2所示。

圖2 通過同源重組機制將外源基因表達盒整合到乳酸克魯維酵母基因組LAC4位點的示意圖Fig. 2 Strategy for integrating heterologous gene expression cassettes into the LAC4 locus of K. Lactis via homologous recombination

1.2.2 CRISPR-Cas技術

2003年，Mojica等發現來自細菌的規律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR）與部分病毒序列相匹配，并推測CRISPR是細菌免疫系統的一部分。隨后，多項研究進一步揭示了CRISPR的功能。如今，CRISPR基因編輯技術發展十分迅速，該技術具有操作簡便、重組效率高、實驗成本低等諸多優點，極大地提高了對各類細胞基因組的編輯效率，并且已經在包括乳酸克魯維酵母在內的許多生物體中得到了成功應用。由于傳統方案需要利用多個篩選標記來進行異源基因整合陽性轉化子的篩選，因此分子操作更加復雜，耗時更長；而CRISPR-Cas系統工作時，sgRNA首先定位到基因組上的目標位點，隨后引導Cas9蛋白對目的基因進行切割，以實現目的基因的精準編輯，因此操作十分簡便高效。Horwitz等在乳酸克魯維酵母中利用CRISPR-Cas技術將6 個外源基因同時整合到基因組的3 個靶向位點上，快速構建了粘康酸的異源合成通路；Burghardt等利用CRISPR-Cas9系統將乳酸克魯維酵母的內源果糖轉化酶基因敲除以后，將合成低聚果糖的果糖轉移酶活性提高了66.9%。經過對CRISPR-Cas系統的不斷探索，研究人員已經實現了對乳酸克魯維酵母工程菌株基因組的高效編輯，與傳統的基因組編輯策略相比，CRISPR-Cas可以實現同時對多個基因的編輯。但目前CRISPR-Cas系統在乳酸克魯維酵母中的應用仍有一些不足之處，如CRISPR-Cas技術對目的基因的識別依賴于前間隔片段臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列（NGG），因而存在一定的局限性。Harrington等研究發現Cas14蛋白在識別目的基因時不依賴于PAM序列，因此有望解決這個問題。此外，sgRNA對于Cas蛋白與目標序列的結合有至關重要的作用，不同的sgRNA特異性和穩定性在微生物底盤中的差異巨大，且容易造成脫靶和效率低等問題。為了解決這一問題，Guo Jiahui等在大腸桿菌中通過對約70 000 個sgRNA的活性及效率等指標進行分析，建立了一個較為全面的sgRNA圖譜，可以針對該模式微生物基因組上的任何位點選擇具有高度活性的sgRNA，有助于提高sgRNA的特異性及解決脫靶問題?？傊?，雖然CRISPR-Cas技術已成功用于對乳酸克魯維酵母基因組的編輯，但該技術尚未在乳酸克魯維酵母中得到廣泛應用，因此也展現出相當大的應用潛力和發展空間。隨著對CRISPR-Cas系統的不斷優化，在乳酸克魯維酵母底盤細胞中進行代謝網絡的重構將變得更加快捷和高效。

1.3 常用宿主菌

和釀酒酵母相同，乳酸克魯維酵母也是雌雄異體菌株，有兩種交配類型：a和α。目前常用的乳酸克魯維酵母菌株主要有NRRL Y-1140（CBS 2359、ATCC 8585）、NRRL Y-I118（CBS 6315、ATCC 8563）和NRRL Y-1205（CBS 2360、ATCC 8651）。其中，NRRL Y-1140是應用最廣泛的菌株，酵母中常用的嗜殺質粒pGKLl和pGKL2也是在該菌株中被首次發現。NRRL Y-1205是一種自然變異菌株，細胞內含有一個隱性的等位基因，在正常培養條件下，該菌株沒有明顯的生長缺陷；但是當細胞呼吸功能被線粒體抑制劑阻斷時，該菌株就不能在含有葡萄糖的培養基上正常生長。研究證明，在其他乳酸克魯維酵母菌株如CBS 141、CBS 5618和CBS 8043中也具有類似功能的等位基因。表3列出了目前分子遺傳學和合成生物學研究中應用最為廣泛的乳酸克魯維酵母宿主/底盤菌株。

表3 常用的乳酸克魯維酵母宿主菌株Table 3 Most commonly used host strains of K. lactis

2 利用合成生物學技術改造乳酸克魯維酵母生產高值產品的應用實例

乳酸克魯維酵母具有外源蛋白表達量高的明顯優勢，因此是外源基因/生物合成途徑表達的優良宿主/底盤細胞。在過去30 年里，已有上百種重組蛋白在乳酸克魯維酵母底盤中實現了異源表達，并有多種蛋白已經實現了工業化生產。本節對近年來以乳酸克魯維酵母底盤細胞所構建的細胞工廠生產蛋白質和其他高附加值產品的實例進行總結。

2.1 已工業化生產的蛋白質產品

荷蘭帝斯曼公司利用乳酸克魯維酵母作為細胞工廠已經成功實現了多種胞內蛋白和外泌蛋白的工業化生產。例如，乳酸克魯維酵母產生的蛋白酶能分解乳糖，因此可以用于乳產品的生產；乳酸克魯維酵母產生的-半乳糖苷酶主要用于生產不含乳糖的乳制品和益生元低聚半乳糖，乳酸克魯維酵母生產的-半乳糖苷酶已經在各大公司得到大規模生產并分別被命名為Maxilact（荷蘭帝斯曼公司）、Lactase（意大利SNAM Progetti公司）、Biolactase（荷蘭Quest International公司）和-Galactosidase（美國Sigma-Aldrich公司）等上市。

2.2 乳酸克魯維酵母在制藥產業的應用潛力

到目前為止，乳酸克魯維酵母已被證明是大規模生產藥物及其中間體的優良底盤細胞，因此在制藥產業中展現出非常大的應用潛力。例如，干擾素β是一種與細胞抵抗病毒和調節免疫反應有關的細胞因子，是一種治療多發性硬化癥的有效藥物。Madhavan等將來自人的干擾素β基因與葡萄糖淀粉酶信號序列融合，克隆到pKLAC1載體中后再導入乳酸克魯維酵母基因組中進行生產，并通過對HeLa細胞進行抗增殖實驗驗證了其生物活性；巨噬細胞刺激因子是一種用于治療造血系統疾病的藥用蛋白，Hua Zhongsheng等在乳酸克魯維酵母中表達了人屬巨噬細胞刺激因子cDNA的截短片段，并成功純化出了具有活性的蛋白。此外，乳酸克魯維酵母還被用于生產治療糖尿病的胰島素前體、-乳球蛋白、白細胞介素1β、人血清白蛋白和其他各種抗體。乳酸克魯維酵母成功表達異源藥用蛋白大大促進了制藥產業向新方向發展，必將成為藥用蛋白的優秀生產菌株。

2.3 其他高值產品的生產

乳酸克魯維酵母除了以上在蛋白生產中的應用以外，其在其他高值產物的生產上同樣具有廣闊的應用前景。例如，-乳酸是被用于生產可降解聚合材料的平臺化學品，Porro等在乳酸克魯維酵母基因組中引入了來自牛的乳酸脫氫酶基因，同時敲除了內源的丙酮酸脫羧酶基因，使工程菌株成功發酵產生了高純度的乳酸，通過生物反應器放大培養，工程菌株中乳酸的終產量達到了109 g/L。與釀酒酵母相比，丙酮酸脫羧酶基因的敲除對乳酸克魯維酵母的生長沒有明顯的影響，因此利用該優勢，通過乳酸生成途徑代替乙醇生成途徑，既成功生產出乳酸，又降低了乙醇產生對乳酸純度的影響；同時也從側面證明了該酵母對低pH值條件有較強的適應性，在低pH值的高值產品生產方面也有很大的潛力。乙醇酸是一種優良的可降解生物材料，Koivistoinen等利用代謝工程及合成生物學技術對乳酸克魯維酵母進行改造，先引入乙醛酸還原酶，成功實現了乙醇酸在乳酸克魯維酵母中的生產，隨后敲除了內源的蘋果酸合酶和異檸檬酸脫氫酶基因來改造該酵母的乙醛酸循環途徑，最終將目標產物產量提高至2 g/L，然后通過生物反應器擴大培養，最終使乳酸克魯維酵母中乙醇酸的產量達到了15 g/L。該研究也對釀酒酵母進行了同樣的代謝改造，然而乳酸克魯維酵母工程菌株乙醇酸的產量卻遠高于釀酒酵母（0.9 g/L），這可能也與乳酸克魯維酵母對低pH值有較強的適應性有關。-抗壞血酸在植物中通常由葡萄糖經10 步反應生成，Rosa等利用代謝工程及合成生物學技術成功構建了能夠生產-抗壞血酸的乳酸克魯維酵母工程菌，首先通過引入來自黑曲霉的鳥苷二磷酸-甘露糖-3,5-異構酶、鳥苷二磷酸--半乳糖-磷酸化酶和-半乳糖-1-磷酸鹽磷酸化酶3 種途徑酶，成功將-半乳糖轉化為-抗壞血酸，工程菌株中-抗壞血酸的終產量達到了30 mg/L。此外，研究人員也開發了可以將低值底物轉化為高值產品的乳酸克魯維酵母細胞工廠，如將-木糖作為底物來生產-木糖酸，利用乳糖為底物生產阿拉伯糖醇等。

乳酸克魯維酵母底盤生產高值產品的部分代表性實例如表4所示。

表4 乳酸克魯維酵母底盤生產高值產品的部分代表性實例Table 4 Representative examples of high-value products produced by engineered K. lactis

3 結 語

隨著合成生物學的快速發展，微生物細胞工廠的深入探索與應用必將成為生物制造的新趨勢。乳酸克魯維酵母是一種十分重要的非常規酵母，其在形態特征、生理特性以及遺傳代謝等方面與常規酵母——釀酒酵母均有較大差異，其中最明顯的區別是乳酸克魯維酵母可以利用廉價的乳清作為唯一碳源進行生長。此外，乳酸克魯維酵母并不受克雷布特效應的影響，所以非常適合大規模的發酵生產。因此，該酵母在微生物基礎研究和應用研究方面都具有非常大的發展潛力。

本文主要對目前乳酸克魯維酵母中常用的合成生物學元件（啟動子、終止子、信號序列、選擇標記和質粒載體等）、最新的基因編輯策略以及以乳酸克魯維酵母為底盤細胞生產高值產品的應用實例進行了系統總結。今后最需要關注的熱點問題包括以下幾點：第一，啟動子和終止子是目前控制基因表達最重要、最有效的功能元件。乳酸克魯維酵母中目前最常用的啟動子和終止子分別是內源的-半乳糖苷酶基因啟動子P和終止子t，而關于人工啟動子和終止子在乳酸克魯維酵母底盤中的理論及應用研究還十分缺乏。因此，要實現外源基因/產物的穩定高效表達，人工啟動子和終止子工程的聯合開發與應用可能是將來的研究重點。第二，隨著先進基因編輯技術如CRISPR-Cas在乳酸克魯維酵母底盤中的快速發展及應用，未來乳酸克魯維酵母工程菌株的開發速度將大大提高。要真正實現乳酸克魯維酵母細胞工廠的快速構建，解決CRISPR-Cas系統對PAM序列的依賴性和脫靶問題仍是將來的研究重心。第三，目前乳酸克魯維酵母細胞工廠的最主要應用仍然集中在工業蛋白的生產上，但是利用其生產大宗化學品、精細化學品和天然產物等高值產物的研究仍然較少。隨著乳酸克魯維酵母合成生物學元件的不斷開發和基因編輯策略的不斷優化，一定會有更多高附加值產品在乳酸克魯維酵母底盤中實現高效生產。此外，實驗室適應性進化是一種較為有效的優良菌株構建策略，利用實驗室適應性進化技術與理性的合成生物學設計相結合，在基因組水平進行多位點同時編輯或連續進化已被證明具有可行性。由于乳酸克魯維酵母底盤天然具有的轉化廉價碳源底物的能力，該方案勢必會極大地推動綠色清潔、可持續發展的乳酸克魯維酵母細胞工廠的構建；該酵母也勢必將成為未來工業生物技術發展中優良的工業微生物細胞工廠。