紫蘇籽多糖分離純化及抗腫瘤活性

劉子坤，尹 賀，楊安皓，安綺沄，李沖偉,3,*，金 濤,*

（1.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；2.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150080；3.哈爾濱美蘇生物科技開發有限公司，黑龍江 哈爾濱 150080）

紫蘇（(L.) Britt）為一年生草本植物，在中國、印度、日本和韓國等地盛產。在中國，紫蘇和紫蘇籽均被國家衛生部列入“藥食同源”名單中。紫蘇籽中含有黃酮、多酚、多肽和迷迭香酸等多種活性成分、以及豐富的不飽和脂肪酸，主要成分-亞麻酸進入人體后可生成二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等，具有降血脂、預防血栓形成、保護心腦血管和提高免疫力的功能。Kwak等發現紫蘇葉乙醇提取物對HCT116大腸癌細胞和H1299肝癌細胞的生長均起到抑制作用，Park等發現紫蘇葉提取物可增強巨噬細胞膽固醇外流能力，并降低動脈粥樣硬化的發生。Thomas等研究發現，紫蘇葉提取物能夠降低高脂飲食導致的高血脂水平，對控制嚙齒類動物肥胖具有一定的功效。目前，大多數研究集中在紫蘇油和紫蘇葉上，對紫蘇粕的功效研究卻鮮有報道。紫蘇粕是紫蘇籽榨油后的副產物，含有豐富的多糖、多肽和黃酮類物質。目前，這些紫蘇粕大部分沒有得到很好的利用，直接作為畜禽飼料，或直接丟棄，不僅造成了資源的浪費，而且污染了周圍的環境。

多糖在多種方面均具有重要生理功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、增強非特異性免疫等。在多糖抗腫瘤研究中發現，多糖可對肝癌、肺癌及乳腺癌等腫瘤細胞起到抑制作用。因此，多糖的抗腫瘤作用被越來越多的研究者關注。本研究以紫蘇籽多糖（seed polysaccharide，PFSP）為對象，并通過構建H荷瘤小鼠模型探究PFSP對小鼠血清細胞免疫因子和相關酶質量濃度，及細胞凋亡相關蛋白表達量的影響，結合腫瘤組織顯微病理切片觀察，闡釋PFSP的抗腫瘤功效，以期為紫蘇籽高值化利用提供理論參考，為開發植物源高效抗腫瘤藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6～8 周齡SPF級昆明種健康小鼠購自哈爾濱市雙城區弘昌養殖場，體質量18～20 g，雌雄各半，生產許可證號：SCXK（黑）2007-0001。

紫蘇籽由哈爾濱美蘇生物科技開發有限公司提供；肝癌瘤株H購自上海富衡生物科技有限公司。

纖維素DEAE-52 福州飛凈生物科技有限公司；Sephadex G-100、G-200葡聚糖凝膠 常州天地人和生物科技有限公司；葡聚糖標準品 中國計量科學研究院；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、醛縮酶（aldolase，ALD）、白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司；環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）藥劑（（CTX）∶（人參莖葉總皂苷）＝1∶1） 吉林通化茂祥制藥有限公司；三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、乙腈、三乙醇胺等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FDU-1100冷凍干燥機 日本EYELA東京理化器械株式會社；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Ulti Mate 3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Dionex公司；Spectrum Two傅里葉變換紅外光譜分析儀美國Perkin Elmer公司；SpectraMax Paradingm多功能酶標儀 美國Bio-Rad公司；LWD 200-37 T倒置顯微鏡日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 PFSP提取

取紫蘇籽榨油后的紫蘇粕廢料粉碎化，過60 目篩，加入石油醚（1∶20，/）脫脂6 h，殘留物用蒸餾水（1∶20，/）在85 ℃提取2 h，此過程重復3 次，收集所有濾液。蒸發濃縮后加入3 倍體積無水乙醇，并在4 ℃下靜置12 h，5 000 r/min離心15 min。沉淀物復溶后加入Sevag試劑（（正丁醇）∶（氯仿）＝1∶3）進行脫蛋白處理，反復多次，直至無明顯殘留。將溶液在自來水、蒸餾水和去離子水內分別透析1 d，冷凍干燥得到粗多糖PFSP。

1.3.2 PFSP的分離及純化

將PFSP復溶后緩慢滴加到經處理的DEAE-52纖維素層析柱（58 cm×4 cm）上，依次用0、0.2、0.4、0.6 mol/L和0.8 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為5 mL/min，5 mL收集一管。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，并根據峰值合并各組分。

將PFSP分離得到的各亞組分別裝載到葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱上，用蒸餾水以5 mL/min流速洗脫，收集洗脫液，每管5 mL，根據峰值合并各組分，冷凍干燥于4 ℃保存。

1.3.3 多糖相對分子質量測定

采用Sephadex G-200柱層析進行相對分子質量測定，將不同分子質量的葡聚糖標準品配制成質量濃度5 mg/mL溶液，0.1 mol/L NaCl溶液進行洗脫，記錄洗脫體積（）。并用藍色葡聚糖相同條件上樣測得外水體積（）。以已知標準品相對分子質量對數值（lg）為縱坐標，/為橫坐標制作標準曲線，并將待測多糖溶液以相同條件上樣，根據標準曲線方程計算該多糖相對分子質量。

1.3.4 單糖組成分析

稱取2.0 mg干燥樣品分別置于安瓿管中，加入3 mL 2 mol/L三氟乙酸，110 ℃條件下水解3 h，水解后冷卻至26 ℃，將樣品移至圓底燒瓶并加入色譜級甲醇，減壓濃縮至干，加入超純水溶解并定容至1.5 mL；取200 μL上述溶液于反應管，加入100 μL 0.6 mol/L氨水溶液，100 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液，混勻、封口，70 ℃下衍生100 min。反應后冷卻至26 ℃，加入200 μL 0.3 mol/L乙酸溶液，氨水中和，搖勻后加入等體積三氯甲烷，萃取分層，收集水相部分，進行HPLC檢測。

檢測條件：色譜柱Agilent eclipse plus C柱（150 mm×4.5 mm，5 μm）；梯度洗脫：流動相A為純乙腈，流動相B為NaHPO緩沖液（0.45 g NaHPO+900 mL去離子水+1.0 mL三乙胺+100 mL乙腈），0～4 min 94% B、4～50 min 88% B；進樣量10 μL；流速1.0 mL/min；紫外檢測器；檢測波長254 nm；柱溫35 ℃。

混合標準品衍生方法同上，衍生后利用HPLC儀檢測。各組分單糖組成定量采用與混合標準樣品中各單糖的峰面積之比的方法表示。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜測定

取樣品與干燥KBr粉末混合、研磨、壓片，在4 000～400 cm范圍內進行紅外光譜掃描。

1.3.6 免疫器官指數及抑瘤率測定

H腫瘤細胞懸液制備：取H腫瘤細胞，3 000 r/min離心10 min，用無菌生理鹽水沖洗腫瘤細胞3 次，稀釋5 倍，取40 μL細胞懸液加入10 μL質量分數0.4%臺酚藍染液，控制細胞濃度為3.0×10個/mL。

動物飼養及荷瘤小鼠模型構建：小鼠雌雄分籠，正常適應性飼養7 d（溫度保持（22±2）℃，相對濕度保持（50±10）%，噪音小于60 dB，模擬白天和晚上的時間各為12 h，自由進食和飲水）。適應性飼養結束后，將小鼠雌雄各半并隨機分為每10 只一組，共6 組。除正常組外，其余各組小鼠一次性頸后皮下注射0.2 mL腫瘤細胞懸液進行造模，7 d后觀察小鼠頸后是否有明顯腫塊，并剔除造模失敗的小鼠。1 d后對造模成功的小鼠進行灌胃處理，正常組和模型組：灌胃0.3 mL純凈水；陽性對照組：灌胃0.3 mL質量濃度1 mg/mL CTX藥劑；PFSP-1組：灌胃0.3 mL質量濃度1 mg/mL PFSP-1溶液；PFSP-2組：灌胃0.3 mL質量濃度1 mg/mL PFSP-2溶液；PFSP-3組：灌胃0.3 mL質量濃度1 mg/mL PFSP-3溶液。

各實驗組小鼠連續灌胃10 d，末次給藥1 d后斷頸處死并稱體質量，摘除脾臟和胸腺用濾紙吸干血液，同時將實體瘤剝離，稱質量，根據公式（1）～（3）分別計算脾指數、胸腺指數和抑瘤率。

1.3.7 血清細胞因子及腫瘤細胞蛋白質量濃度測定

將PFSP-2設定低、中、高劑量組，進一步探究PFSP-2對荷瘤小鼠血清細胞因子和腫瘤細胞蛋白的影響。低劑量組：灌胃0.1 mL質量濃度1 mg/mL PFSP-2溶液；中劑量組：灌胃0.3 mL質量濃度1 mg/mL PFSP-2溶液；高劑量組：灌胃0.5 mL質量濃度1 mg/mL PFSP-2溶液。

采用酶聯免疫吸附測試法測定小鼠血清中細胞因子質量濃度。各實驗組小鼠眼廓采血，3 000 r/min離心20 min取血清。按照試劑盒方法測定IL-2、TNF-α、IL-10、LDH及ALD的質量濃度。

按照試劑盒說明書收集腫瘤細胞，抽提細胞總蛋白，測定蛋白濃度。將蛋白放置在聚丙稀酰胺凝膠電泳膜上，并依次孵育一抗、二抗，經顯影及定影后置于成像分析系統。掃描蛋白條帶灰度，分析及比較各樣本的目的蛋白及參照蛋白條帶灰度，計算蛋白相對表達量。

1.3.8 腫瘤細胞形態觀察

將腫瘤組織固定于體積分數10%甲醛溶液中滲透12 h，脫水后石蠟包埋，切片后利用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法進行染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織細胞形態（400×）。

1.4 數據統計與分析

使用SPSS 16.0軟件進行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）對所有數據進行統計學分析，所有實驗重復進行3 次，結果用平均值±標準偏差表示，進行Fisher最小顯著性差異檢驗和檢驗。＜0.05表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 PFSP分離純化組成

紫蘇粕中粗多糖的得率為8.38%。粗多糖為淺棕色且呈海綿多孔狀，室溫下微溶于水。PFSP分離純化結果如圖1所示，利用DEAE-52纖維素柱對PFSP進行分離，粗多糖主要由3 種多糖組分構成，分別通過蒸餾水、0.2、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫得到，說明組分1為中性多糖、組分2和3為酸性多糖。利用Sephadex G-100層析柱對3 種粗多糖組分進行純化，每個粗多糖組分均為單一且較寬的洗脫峰。各多糖組分冷凍干燥后稱質量，分別占粗多糖的23.22%、28.15%和20.32%。

圖1 PFSP的分離和純化Fig. 1 Isolation and purification of Perilla frutescens seed polysaccharide

2.2 PFSP各組分相對分子質量

PFSP各組分經Sephadex G-200層析柱和苯酚-硫酸法跟蹤檢測，通過葡聚糖標準曲線方程＝-1.763 2+7.171 3（＝0.982 9），得到PFSP-1相對分子質量約為1.06×10，PFSP-2相對分子質量約為5.96×10，PFSP-3相對分子質量約為3.72×10。

2.3 PFSP各組分單糖組成

利用HPLC得到混合單糖標準品HPLC圖（圖2），并通過與單糖標準品HPLC圖對比分析，可得到各多糖組分的單糖組成（圖3）。由圖3可知，PFSP-1由甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，其物質的量之比為0.01∶0.06∶0.11∶0.81；PFSP-2由甘露糖、木糖和阿拉伯糖組成，其物質的量比為0.28∶0.28∶0.41；PFSP-3由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，其物質的量之比為0.013∶0.024∶0.040∶0.080∶0.120∶0.700。由此可知，3 種多糖組分是由不同單糖及不同物質的量之比組成的雜多糖。

圖2 混合單糖標準品HPLC圖Fig. 2 High performance liquid chromatogram of mixed monosaccharide standard

圖3 PFSP-1（A）、PFSP-2（B）和PFSP-3（C）HPLC圖Fig. 3 High performance liquid chromatograms of PFSP-1 (A), PFSP-2 (B)and PFSP-3 (C)

2.4 PFSP各組分傅里葉變換紅外光譜分析

PFSP-1、PFSP-2和PFSP-3紅外光譜如圖4所示，各組分均具有多糖特征吸收峰，且PFSP-2特征吸收峰強度明顯高于其他組分。在3 440 cm和2 925 cm處的吸收峰均為糖類化合物的特征吸收峰，分別是由于—OH拉伸振動和—CH或—CH中C—H的拉伸和彎曲振動引起，表明多糖中存在分子內和分子間氫鍵；在1 640 cm處的強吸收峰是C＝O的不對稱伸縮振動；在1 420 cm處的強吸收峰為變形的C—H鍵振動峰；在1 050 cm處的特征吸收峰，證明PFSP-1、PFSP-2和PFSP-3均含有吡喃糖環，為吡喃環型多糖。除以上均出現的吸收峰外，PFSP-2在1 250 cm和1 075 cm處存在吸收峰，說明在PFSP-2中含有C—O糖苷鍵，且分子中含有硫酸根。

圖4 PFSP-1、PFSP-2和PFSP-3傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of PFSP-1,PFSP-2 and PFSP-3

2.5 PFSP對小鼠免疫器官指數及抑瘤率的影響

免疫功能的下降與腫瘤的發生息息相關，脾指數和胸腺指數可反映機體免疫機能的強弱。如圖5A、B所示，與正常組相比，模型組脾指數和胸腺指數均顯著降低（＜0.05），說明腫瘤細胞使小鼠的脾臟和胸腺生長發育受到抑制，進而造成脾臟和胸腺的質量降低。PFSP-1、PFSP-2組和PFSP-3組小鼠脾指數和胸腺指數均顯著高于陽性對照組（＜0.05），與正常組無顯著差異（＞0.05），表明PFSP能減少腫瘤細胞對小鼠脾臟和胸腺的損傷，使免疫器官質量增加，這與Liu Yanhong等的研究結果一致。3 個PFSP處理組間脾指數與胸腺指數也存在差異，但均呈現PFSP-2＞PFSP-1＞PFSP-3，說明PFSP-2對免疫器官的保護作用優于其他多糖組分。

如圖5C所示，PFSP-2抑瘤率為30.14%，顯著高于其他兩組分（＜0.05），這與脾指數和胸腺指數的變化趨勢一致。在相同劑量濃度下，香菇多糖抑瘤率為23.31%，根據中草藥抗腫瘤有效性的標準（抑瘤率＞30%），說明PFSP-2具有較好的抑制腫瘤生長的作用。

圖5 PFSP對小鼠免疫器官指數及抑瘤率的影響Fig. 5 Effect of PFSP on immune organ indexes and tumor inhibition in mice

PFSP-2組免疫器官指數及抑瘤率均高于其他多糖組分，因此，本實驗進一步探討PFSP-2對H荷瘤小鼠免疫細胞因子和腫瘤細胞的影響。

2.6 PFSP-2對荷瘤小鼠血清細胞因子質量濃度的影響

細胞因子來源廣泛，主要由造血系統和免疫系統等途徑產生，可調節細胞增殖和分化，在不影響其他正常細胞生長和增殖的情況下，可殺傷腫瘤細胞。

2.6.1 PFSP-2對IL-2質量濃度的影響

如圖6所示，隨著PFSP-2劑量的增加，IL-2質量濃度逐漸上升，具有正向調節作用。模型組IL-2質量濃度顯著低于正常組（＜0.05），說明模型組腫瘤細胞生長，證明荷瘤小鼠建模成功。PFSP-2高劑量組IL-2質量濃度達到133.75 pg/mL，顯著高于模型組（＜0.05），與陽性對照組（質量濃度141.53 pg/mL）和正常組（質量濃度159.27 pg/mL）差異不顯著（＞0.05），說明高劑量PFSP-2增強了免疫因子的調節作用，推測是由于IL-2調節了T細胞和巨噬細胞的功能，使機體免疫系統的保護能力增強，進而對腫瘤細胞的生長起到了抑制效果。

圖6 不同劑量PFSP-2對荷瘤小鼠血清中IL-2質量濃度的影響Fig. 6 Effect of PFSP-2 at different concentrations on serum IL-2 concentration in tumor bearing mice

2.6.2 PFSP-2對TNF-α質量濃度的影響

如圖7所示，隨著PFSP-2劑量的增加，TNF-α質量濃度逐漸上升。PFSP-2低劑量、中劑量和高劑量組TNF-α質量濃度均顯著高于模型組（質量濃度103.77 pg/mL）（＜0.05），分別提高了53.59%、93.47%和130.74%，但顯著低于陽性對照組和正常組（＜0.05）。PFSP-2可能是通過促使TNF-α表達量升高，使腫瘤細胞的相關蛋白變性失活，使腫瘤細胞的生長受到抑制而無法存活。TNF-α質量濃度變化同IL-2呈現相同趨勢，是由于TNF-α可促使巨噬細胞等免疫細胞活性增強，進一步使IL分泌量增加，兩者協同促使腫瘤細胞凋亡。

圖7 不同劑量PFSP-2對荷瘤小鼠血清中TNF-α質量濃度的影響Fig. 7 Effect of PFSP-2 at different concentrations on serum TNF-α concentration in tumor bearing mice

2.6.3 PFSP-2對IL-10質量濃度的影響

如圖8所示，隨著PFSP-2劑量的增加，IL-10質量濃度逐漸降低，具有反向調節作用。PFSP-2低劑量、中劑量和高劑量組IL-10質量濃度顯著低于模型組（＜0.05），且PFSP-2高劑量組與陽性對照組無顯著差異（＞0.05），說明高劑量PFSP-2可大幅降低IL-10水平，與CTX治療效果相當。各實驗組IL-10質量濃度顯著高于正常組（＜0.05），說明各實驗組荷瘤小鼠有腫瘤細胞生長，血清IL-10質量濃度升高，陽性對照組和高劑量組IL-10質量濃度上升較慢，說明腫瘤細胞數量減少。由此可知，當免疫系統啟動時，IL-10質量濃度升高，以減輕外來異物對機體造成的損傷。IL-10可使巨噬細胞等多種免疫細胞產生細胞因子的能力受到抑制，抑制TNF-α的產生，IL-10質量濃度與本研究TNF-α變化趨勢相反，這與Zhang Shaopeng等的研究結論一致。

圖8 不同劑量PFSP-2對荷瘤小鼠血清中IL-10質量濃度的影響Fig. 8 Effect of PFSP-2 at different concentrations on serum IL-10 concentration in tumor bearing mice

2.7 PFSP-2對LDH、ALD質量濃度的影響

如圖9所示，隨著PFSP-2劑量的增加，LDH和ALD的質量濃度逐漸降低，具有反向調節作用。與模型組相比，PFSP-2各劑量組LDH及ALD質量濃度均顯著降低（＜0.05），LDH質量濃度分別降低了21.96%、31.57%和41.91%，ALD質量濃度分別降低了17.84%、29.39%和43.96%。小鼠經接種腫瘤細胞懸液造模成功后，模型組LDH、ALD質量濃度顯著升高，陽性對照組LDH、ALD質量濃度顯著低于模型組（＜0.05），說明CTX可降低腫瘤細胞的損傷作用，各劑量PFSP-2也具有降低LDH、ALD質量濃度的作用，但與陽性對照組相比，效果差異顯著（＜0.05）。

圖9 不同濃度PFSP-2對荷瘤小鼠血清中LDH（A）和ALD（B）質量濃度的影響Fig. 9 Effect of PFSP-2 at different concentrations on LDH (A) and ALD (B) concentrations in tumor bearing mice

2.8 PFSP-2對細胞凋亡相關蛋白表達量的影響

由圖10A、B可知，模型組，陽性對照組及PFSP-2低、中、高劑量組Bax相對表達量依次為0.03、0.45、0.04、0.08和0.23，Bcl-2相對表達量依次為1.26、0.26、0.71、0.55和0.36。與模型組相比，PFSP-2中劑量組和高劑量組Bax相對表達量顯著提高（＜0.05），而PFSP-2低劑量、中劑量組和高劑量組Bcl-2相對表達量顯著降低（＜0.05），由此說明，PFSP-2可上調腫瘤細胞中Bax蛋白的表達，下調Bcl-2蛋白的表達，即PFSP-2可增大腫瘤細胞中Bax/Bcl-2比例，比例的增大表示對腫瘤細胞的促凋亡作用增大。蛋白免疫印跡分析結果表明（圖10C），PFSP-2各劑量組腫瘤細胞Bcl-2蛋白條帶灰度逐漸變淺，說明Bcl-2表達量逐漸減少，而Bax相對表達量變化與Bcl-2相反。

圖10 不同濃度PFSP-2對荷瘤小鼠腫瘤細胞蛋白Bax、Bcl-2相對表達量的影響Fig. 10 Effect of PFSP-2 at different concentrations on the relative expression levels of Bax and Bcl-2 in tumor cells

2.9 PFSP-2對荷瘤小鼠腫瘤組織細胞形態的影響

各組小鼠腫瘤組織細胞切片結果如圖11所示，經HE染色后腫瘤細胞的細胞核和細胞質呈現藍色和粉紅色。模型組腫瘤細胞形態比較整齊、結構清晰，腫瘤細胞異型性強，多見分裂相；陽性對照組腫瘤細胞出現細胞核固縮變小和染色加深等類似凋亡的特征，可見多處發生細胞壞死現象；隨著PFSP-2劑量增加，腫瘤細胞逐漸疏松并膨大，直至破裂死亡，細胞質溶出，并伴有空泡產生。同時還能發現，PFSP-2組細胞凋亡現象與陽性對照組不同，這可能是由于兩種不同作用機制所導致的細胞凋亡。綜上，可推測PFSP-2可以通過調節機體內細胞因子分泌增強免疫調節能力，使腫瘤細胞發生破裂死亡。

圖11 H22荷瘤小鼠腫瘤組織細胞形態（400×）Fig. 11 Histomorphological results of tumor tissues in H22 tumorbearing mice (400 ×)

3 結 論

本實驗從紫蘇粕中提取粗多糖，經DEAE-52纖維素和葡聚糖G-100柱層析分離純化后得到3 個組分，分別為中性多糖PFSP-1、酸性多糖PFSP-2和PFSP-3，這3 種多糖組分相對分子質量分別約為1.06×10、5.96×10、3.72×10。單糖組成分析得出，3 種多糖為多種不同單糖構成的雜多糖。傅里葉變換紅外光譜表明，3 種多糖均具有多糖的特征性吸收峰，且推斷出3 種多糖可能均屬于吡喃環型多糖。免疫器官指數及抑瘤率結果表明，3 種多糖均可使模型小鼠脾指數和胸腺指數提高，PFSP-2提升幅度明顯，且抑瘤率顯著高于PFSP-1和PFSP-3。各劑量PFSP-2均可使荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α質量濃度顯著升高（＜0.05），IL-10質量濃度顯著降低（＜0.05），且變化趨勢均呈劑量依賴性，說明PFSP-2能提高IL-2對淋巴細胞的刺激，起到預防和控制癌細胞增殖的作用；PFSP-2能促使T細胞殺傷腫瘤細胞，導致TNF-α質量濃度升高；PFSP-2可通過抑制IL-10質量濃度升高，減輕單核巨噬細胞的特異性免疫功能受損。荷瘤小鼠血清LDH、ALD質量濃度隨PFSP-2劑量的升高而降低，說明PFSP-2可減輕腫瘤細胞的損傷，進而減少正常細胞破裂的發生。PFSP-2可下調荷瘤小鼠腫瘤細胞Bcl-2蛋白表達且上調Bax蛋白表達。腫瘤組織切片細胞形態表明，PFSP-2使腫瘤細胞產生膨大破裂導致凋亡，與CTX相比顯示出不同的抑瘤機制。以上實驗結果表明PFSP-2具有較好的抑瘤效果，推測可能是由于PFSP-2可更好地激活或調節免疫細胞產生細胞因子的能力，并通過免疫機制致使腫瘤細胞凋亡。PFSP有望開發為新型抗腫瘤藥物佐劑。