榆干離褶傘溶栓酶對動脈血栓大鼠血管內膜的保護作用

崔日花，李 鈺，蘇 新，衛 瑩，陳佳芮，沈明花,*

（1.延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學醫學院，吉林 延吉 133002）

血栓形成過程中伴有血管的炎癥性損傷，內皮細胞、血小板以及白細胞之間的相互作用是血管壁發生炎癥性損傷的病理基礎。血管內皮細胞的結構及功能障礙、血小板的過度活化是血栓形成的重要因素。當血管內皮的完整性遭到破壞時內皮下膠原被暴露，激活血小板，從而啟動血栓的形成。血小板的異常活化可導致病理性血栓的形成。活化的血小板不僅參與血栓的形成，還通過脫顆?；蜥尫?-羥色胺、細胞因子、組織胺等活性物質參與并促進炎癥反應。血小板通過與血管內皮細胞以及白細胞之間的相互作用，促進血小板和白細胞在血管內皮細胞的黏附、滾動，從而加重炎癥反應。因此，保護血管內皮細胞和抑制血小板的過度活化對血栓性疾病的治療及預后具有重要意義。

榆干離褶傘（）屬擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、離褶傘屬，分布于我國河北、吉林等地。作為食藥用菌，榆干離褶傘具有抗氧化、保肝、抗栓等功效。榆干離褶傘溶栓酶（fibrinolytic enzyme，LUFE）是榆干離褶傘菌絲體中分離純化的一種溶栓酶，具有抗栓、保護血管內皮細胞等作用。研究表明LUFE抑制血栓形成過程中血小板的過度活化。諸多研究結果表明，血栓形成過程中并存炎癥反應，而且這種炎癥反應和血栓的形成相互聯系、相互促進。血小板作為炎癥細胞，在這種血栓-炎癥過程中發揮重要作用。本研究通過大鼠動脈血栓模型研究LUFE在血栓形成過程中對血管內膜炎性損傷的保護作用；同時在體外觀察膠原誘導的血小板活化過程中LUFE對血小板黏附功能的影響及其對相關信號通路的調控作用，進一步明確其抗栓及抗炎機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

50 只SD大鼠（SCXK（吉）2017-0003，SYXK（吉）2020-0010），雌雄各半，體質量180～200 g，延邊大學實驗動物中心提供。

LUFE從榆干離褶傘菌絲體中分離提取，由延邊大學醫學院生物化學與分子生物學教研室提供。

C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血小板-內皮細胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion moleculer-1，PECAM-1）試劑盒上海嚴謹生物科技有限公司；四甲基異硫氰酸羅丹明標記鬼筆環肽（tetramethylrhodamine isothiocyanate Phalloidin，TRITC Phalloidin）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京索萊寶科技有限公司；鈣離子熒光探針Fluo-4 AM 美國BD公司；膠原 美國Chrono-log公司；T細胞跨膜連接蛋白（linker for activation of T cells，LAT）抗體、磷酸化LAT（phospho-LAT，p-LAT）抗體、磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）抗體、磷酸化PLCγ（phospho-PLCγ，p-PLCγ）抗體 英國Abcam公司；-actin抗體 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

RT-2100型酶標儀 深圳雷杜公司；流式細胞儀美國Beckman公司；凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；BX53F光學顯微鏡 日本Olympus株式會社。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及模型的建立

將50 只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、阿司匹林組、LUFE低劑量組和LUFE高劑量組，每組10 只。阿司匹林組（10 mg/kg阿司匹林）和LUFE低（100 mg/kgLUFE）、高（400 mg/kgLUFE）劑量組分別按相應劑量灌胃阿司匹林或LUFE（用水溶解后進行灌胃，灌胃體積為2 mL），連續灌胃7 d，假手術組和模型組灌胃等體積生理鹽水。次日，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠后以建立頸動脈血栓模型。正中切開頸部，鈍性分離右側頸總動脈。假手術組用浸有生理鹽水的濾紙（1.0 cm×1.5 cm）包裹頸總動脈，濾紙外用無菌手術巾（1.0 cm×1.5 cm）包裹。其余各組以浸有20%（質量分數）三氯化鐵（FeCl）溶液的濾紙替代浸有生理鹽水的濾紙。20 min后取下濾紙，更換新的無菌手術巾，并用浸有生理鹽水的紗布濕敷暴露的頸動脈。40 min后結扎與手術巾等長的血管，并剪下該段頸動脈備蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。剖胸，暴露心臟，用采血管采血，取100 μL全血用于流式細胞儀測定血小板-白細胞聚集體（platelet-leukocyte aggregates，PLA）水平。全血室溫放置1 h，2 500 r/min離心10 min，取其上清液即為血清，-20 ℃保存以備用。

1.3.2 血管組織形態學檢查

以4%（質量分數，下同）多聚甲醛溶液固定1.3.1節收集的大鼠頸動脈組織，經HE染色后置于200 倍光學顯微鏡下觀察血管腔及血管壁結構變化。

1.3.3 血清CRP、IL-6、IL-8、MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質量濃度的測定

取1.3.1節得到的血清，分別按照試劑盒說明書用酶聯免疫吸附法測定血清中CRP、IL-6、IL-8、MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質量濃度。

1.3.4 PLA水平的測定

假手術組、模型組、阿司匹林組、LUFE高劑量組分別取50 μL大鼠全血置于1.5 mL離心管中，每管加入1 mL的紅細胞裂解液后避光反應10 min。每管以500×離心5 min，棄去上清液，加入500 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2，下同）洗滌細胞，再以500×離心5 min。棄去上清液，用PBS定容至100 μL。在細胞懸液中加入藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的CD45和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的CD61抗體各2 μL，同型對照管中加入FITC標記的免疫球蛋白G1。避光孵育20 min后加入預冷的1%（質量分數）多聚甲醛溶液。4 h內用流式細胞分析儀進行檢測，按下式計算PLA水平。

1.3.5 血小板懸液的制備

取健康志愿者的靜脈血，用臺氏液按照1∶1等體積稀釋全血，同時加入前列腺素E1（prostaglandine 1，PGE1）（終質量濃度為50 ng/mL），然后以200×離心15 min，收集上清液后再以1 000×離心10 min，棄去上清液。用1.5 倍體積的臺氏液重懸血小板，并加入PGE1（終質量濃度為50 ng/mL）以及乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（終濃度為1 mmol/L），混勻后850×離心10 min，棄去上清液。用臺氏液重懸血小板，并調整血小板濃度為3×10個/mL。

1.3.6 熒光染色法檢測血小板在固化膠原上的黏附

24 孔板分為空白對照組、正常對照組以及LUFE低、中、高劑量組。將干凈的蓋玻片放入24 孔板中，空白對照組以250 μL 1%（質量分數，下同）BSA溶液包被，正常對照組以及LUFE不同劑量組以250 μL 5 μg/mL膠原包被，4 ℃靜置12 h后用PBS洗滌，每孔加入1% BSA溶液封閉1 h后吸棄多余的BSA溶液，用PBS洗滌。將1.3.5節制備的血小板懸液用臺氏液稀釋成2×10個/mL，取血小板懸液分別加入不同劑量的LUFE溶液（終質量濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL），空白對照組和正常對照組加入等體積臺氏液，在37 ℃孵育5 min。分別取250 μL上述孵育后的各組血小板懸液加到24 孔板對應組中，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定15 min，隨后用PBS洗滌。每孔加入200 μL TRITC Phalloidin避光染色1 h，然后用PBS洗滌，采用熒光顯微鏡進行觀察，并用Image J軟件分析計算黏附面積（以相對面積百分比表示）。

1.3.7 流式細胞術檢測血小板Ca水平

將1.3.5節制備的血小板懸液分為4 組：正常對照組、膠原組以及LUFE低劑量（0.5 mg/mL）和高劑量（2.0 mg/mL）組。LUFE低、高劑量組在3×10個/mL的血小板懸液中分別加入終質量濃度為0.5、2.0 mg/mL的LUFE溶液，其余2 組的血小板懸液中分別加入等體積的臺氏液，37 ℃孵育5 min。隨后在膠原組和LUFE不同劑量組的血小板懸液中加入終質量濃度2 μg/mL的膠原溶液，正常對照組的血小板懸液中加入等體積的臺氏液，在37 ℃孵育5 min。在各組血小板懸液中分別加入Fluo-4 AM染料（終濃度為5 μmol/L），37 ℃避光孵育30 min。在避光條件下，以臺氏液洗滌多余的染料，300×離心5 min。用500 μL臺氏液重懸，用流式細胞儀測定熒光強度，以表征血小板內Ca水平。

1.3.8 Western blot檢測LAT和PLCγ磷酸化水平

將1.3.5節制備的血小板懸液分為5 組：正常對照組、膠原組和LUFE低、中、高劑量組。LUFE低、中、高劑量組在血小板懸液（3×10個/mL）中分別加入終質量濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL的LUFE溶液，正常對照組和膠原組的血小板懸液中加入等體積臺氏液，在37 ℃孵育5 min。除正常對照組以外的其余4 組分別加入終質量濃度2 μg/mL膠原溶液37 ℃孵育5 min。各組血小板懸液中分別加入蛋白裂解液并在冰浴中裂解30 min，然后12 000 r/min離心15 min，取上清液即為血小板蛋白樣品。用BCA試劑盒進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉模至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。然后將PVDF膜用5%（質量分數）脫脂奶粉封閉2 h，分別加入相應的一抗，在4 ℃孵育12 h。用TBST洗滌3 次后加入二抗，在室溫孵育2 h，洗滌3 次，然后用凝膠成像儀進行分析，用磷酸化蛋白條帶灰度占蛋白條帶灰度的比例表征磷酸化水平。

1.4 數據處理與分析

實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，采用檢驗進行顯著性分析，＜0.05差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 LUFE對動脈血栓大鼠血管組織形態學的影響

如圖1所示，假手術組頸動脈內膜光滑完整，血管內皮細胞排列連續，無血管內皮細胞剝脫，管腔內未見血栓形成和炎癥細胞浸潤。模型組血管內膜氧化損傷，內膜上未見血管內皮細胞，管腔內可見較多的炎癥細胞和混合血栓的形成。與模型組相比，阿司匹林組和LUFE高劑量組血管內膜的損傷程度減輕，血栓形成比較稀疏，血小板聚集程度明顯減少，偶見少量的炎性細胞。

圖1 LUFE對頸動脈血栓大鼠血管形態的影響（200×）Fig. 1 Effect of LUFE on carotid arterial tissue morphology in rats (200 ×)

2.2 LUFE對動脈血栓大鼠血清IL-8、IL-6和CRP質量濃度的影響

由巨噬細胞、上皮細胞等分泌的IL-8具有趨化中性粒細胞的作用，還可以激活中性粒細胞分泌一些生物活性物質，促進局部的炎癥反應。IL-6作為促炎因子，可以誘導高凝狀態，促進內皮素的生成，引起血管壁的損傷，從而促進血栓形成。CRP作為炎癥、感染和組織損傷的非特異性標志物，與急性期反應相關，可以促進血小板活化和血栓形成。如表1所示，模型組大鼠的IL-8、IL-6和CRP質量濃度顯著或極顯著高于假手術組（＜0.05、＜0.01），提示FeCl作用于血管壁后引起局部組織的炎癥反應。與模型組相比，阿司匹林組IL-8、CRP質量濃度極顯著下降（＜0.01），而LUFE高劑量組IL-8、IL-6和CRP質量濃度顯著或極顯著下降（＜0.05、＜0.01），說明阿司匹林和高劑量的LUFE可以抑制炎癥因子的產生或釋放。

表1 LUFE對IL-8、IL-6和CRP質量濃度的影響Table 1 Effect of LUFE on serum levels of IL-8, IL-6 and CRP

2.3 LUFE對動脈血栓大鼠血清MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質量濃度的影響

MCP-1主要由血管內皮細胞、平滑肌細胞等細胞表達，具有趨化激活單核細胞的作用，在炎癥過程中起重要作用。ICAM-1為跨膜糖蛋白，存在于血管內皮細胞和外周白細胞，參與白細胞與血管內皮細胞之間的黏附及白細胞向血管外遷移。PECAM-1是一種在血小板、單核細胞及中性粒細胞中表達的黏附分子，在內皮細胞損傷時促進血小板與內皮細胞的黏附及白細胞的遷移。如表2所示，模型組大鼠MCP-1、PECAM-1質量濃度極顯著高于假手術組（＜0.01）。與模型組相比，經阿司匹林或LUFE干預的大鼠MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質量濃度極顯著下降（＜0.01），提示阿司匹林和LUFE能一定程度地減弱炎癥細胞的趨化和細胞間的黏附反應。

表2 LUFE對MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質量濃度的影響Table 2 Effect of LUFE on serum levels of MCP-1, ICAM-1 and PECAM-1

2.4 LUFE對動脈血栓大鼠PLA水平的影響

血小板表達的黏附分子與活化的中性粒細胞或單核細胞相互作用，形成PLA，其水平是反映體內炎癥-血栓狀態的敏感指標之一。如圖2所示，與假手術組相比，模型組大鼠PLA水平顯著升高（＜0.05），提示血栓性形成過程中伴有炎癥。與模型組相比，LUFE高劑量大鼠的PLA水平顯著降低（＜0.05），提示LUFE具有抑制血栓形成過程中的炎癥反應。

圖2 LUFE對PLA水平的影響Fig. 2 Effect of LUFE on serum levels of PLA

2.5 LUFE對血小板在固化膠原上黏附的影響

如圖3所示，空白對照組中見到少量的血小板黏附在BSA表面，其黏附面積為（0.77±0.44）%，說明血小板在BSA表面黏附很少。正常對照組血小板在膠原上的黏附面積為（16.97±2.52）%，與空白對照組相比極顯著增多（＜0.01）。LUFE低、中、高劑量組血小板在膠原上的黏附面積分別為（13.79±1.08）%、（9.22±1.77）%、（7.08±1.56）%，與正常對照組相比顯著或極顯著降低（＜0.05、＜0.01），提示LUFE能抑制血小板在膠原上的黏附。

圖3 LUFE對血小板在膠原上黏附的影響Fig. 3 Effect of LUFE on platelet adhesion to collagen

2.6 LUFE對血小板Ca2+水平的影響

鈣離子熒光探針Fluo-4 AM常用于檢測細胞內的Ca水平。細胞內的酯酶催化Fluo-4 AM裂解后結合Ca產生較強的熒光。因此，本實驗選用Fluo-4 AM染料檢測血小板內Ca水平。如圖4所示，膠原組熒光強度為54.26±4.24，與正常對照組（19.76±1.63）相比，熒光強度極顯著升高（＜0.01）；LUFE低、高劑量組血小板熒光強度分別為52.11±2.34和37.45±3.54，與膠原組相比明顯降低。結果說明LUFE能夠抑制膠原引起的血小板內Ca水平的升高。

圖4 LUFE對血小板內Ca2＋水平的影響Fig. 4 Effect of LUFE on Ca2+ levels in platelets

2.7 LUFE對血小板LAT、PLCγ蛋白磷酸化水平的影響

如圖5所示，與正常對照組比較，膠原組血小板LAT、PLCγ的磷酸化水平極顯著升高（＜0.01）；與膠原組相比，LUFE低劑量組血小板PLCγ磷酸化水平顯著下降（＜0.05），中、高劑量組血小板LAT、PLCγ磷酸化水平顯著或極顯著降低（＜0.05、＜0.01），提示LUFE不同程度抑制膠原誘導的LAT、PLCγ的活化。

圖5 LUFE對血小板LAT、PLCγ磷酸化水平的影響Fig. 5 Effect of LUFE on the phosphorylation levels of LAT and PLCγ in platelets

3 討 論

血栓形成是引發心血管疾病的重要因素之一。文獻報道，血栓形成與炎癥密切相關，而在此過程中血管內皮細胞、血小板和炎癥細胞之間的相互作用影響其病理進程。研究表明，內皮細胞合成的一氧化氮、前列環素等血管活性物質，調節血管張力和血小板反應性，從而防止血栓形成。血管內皮細胞分泌或表達的細胞因子影響血小板的活化及炎癥細胞在內皮上的黏附、滾動及遷移，進而影響血栓-炎癥過程。因此，保護血管內皮細胞在一定程度上可以控制血栓的形成以及炎癥反應，這對心血管疾病的防治具有重要意義。

本實驗以FeCl誘導大鼠頸動脈血栓模型，觀察了LUFE對血管內膜損傷的保護作用。結果表明，LUFE能減輕血栓形成過程中血管內膜的損傷，并降低血清IL-8、IL-6、CRP、MCP-1、ICAM-1和PECAM-1質量濃度。這表明LUFE可能通過降低炎癥因子、趨化因子及細胞黏附分子水平，抑制局部的炎癥反應從而保護血管內膜。

血小板的激活在血栓形成過程中發揮至關重要的作用。當血管內膜損傷引起膠原暴露時血小板被活化并黏附于膠原上。另外，活化的血小板通過表達特定細胞因子，如P選擇素、趨化因子配體5（chemokine ligand 5，CCL5）和CD40L等，影響細胞間的黏附及白細胞在內皮細胞上的滾動和遷移等過程。在這個過程中白細胞膜上的P選擇素糖蛋白配體1、CCR5和CD40與血小板上的相應配體結合，形成PLA，進一步促進炎癥反應。本實驗結果顯示，LUFF干預后動脈血栓大鼠PLA水平降低，說明LUFE可能通過抑制血小板或白細胞的活化，從而抑制兩者的結合進而減輕血管內膜的炎性損傷。前期研究表明，大鼠頸動脈血栓模型中LUFE降低血小板膜CD62P的表達，這與本研究結果相符。

另外，本研究采用體外模擬的方法，觀察了血小板黏附膠原過程中LUFE的干預作用，并檢測了血小板Ca水平的變化。結果顯示，LUFE能顯著抑制血小板與膠原的黏附，并降低血小板內Ca水平，提示LUFE能一定程度地抑制血小板的活化。為了闡明其作用機制，觀察了LUFE對膠原誘導的血小板膜糖蛋白VI（glycoprotein VI，GPVI）信號通路的調控作用。當膠原作用于血小板膜GPVI受體復合物時，通過Src家族激酶的作用，激活Fc受體γ的免疫受體酪氨酸激活基序，繼而活化酪氨酸激酶。后者進一步激活包括LAT在內的下游信號，引起PLCγ的活化，促進甘油二酯和三磷酸肌醇的生成。三磷酸肌醇作為第二信使促進細胞內存儲Ca的釋放，導致細胞內游離Ca濃度升高，從而促進血小板的活化。本研究結果顯示，LUFE干預能下調GPVI信號通路中的LAT和PLCγ蛋白的磷酸化水平，提示LUFE可能通過調控GPVI信號通路相關蛋白的激活而影響細胞內Ca水平，進而抑制血小板的活化。

綜上所述，LUFE抑制血栓形成過程中血管內膜的損傷，其機制可能與LUFE的抗炎作用以及抗血小板活化有關。