紫甘薯多糖分離、組分鑒定及抗氧化代謝機理

袁 博，卜 偉，戴威威，鞠秀云，王 欣,*

（1.江蘇徐淮地區(qū)徐州農業(yè)科學研究所，農業(yè)農村部甘薯生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇 徐州 221131；2.江蘇師范大學生命科學學院，江蘇 徐州 221116）

紫甘薯是甘薯（）的一種紫色品種，是重要的經濟作物，可作為糧食、飼料和工業(yè)原料使用，具有重要的產業(yè)地位。研究表明，紫甘薯塊根提取物具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用，可用于預防心血管疾病和糖尿病，保健功能開發(fā)價值極高。

紫甘薯中含有多種重要的活性成分，如花色苷、多酚、黃酮和多糖。其中多糖是具有抗氧化、抗腫瘤、調節(jié)免疫、降血糖等功效的一類天然生物大分子，也是食品中重要的功能因子之一。研究開發(fā)紫甘薯多糖，探究其活性機制是目前紫甘薯多糖研究領域熱點問題。Sun Jian等從紫甘薯中分離獲得一種堿溶性多糖，研究表明其具有調節(jié)腸道微生物和抗炎癥的活性。Tang Chao等從紫甘薯中分離獲得一種可以調節(jié)免疫力的多糖，研究表明其可以增強小鼠體內免疫球蛋白A等免疫蛋白的表達水平。此外，紫甘薯多糖還在抗氧化、抗腫瘤、益生和護肝方面具有重要的應用潛力。

由于氧化因子的存在，細胞內會因氧化和抗氧化作用失衡導致氧化應激的發(fā)生，細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累過量時會破壞細胞內生物大分子，如造成蛋白質氧化和DNA損傷，最終導致機體產生病理變化。目前，對于細胞氧化損傷的研究主要集中于測定氧化損傷過程中關鍵酶（如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalyse，CAT）和谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px））活力以及脂質氧化產物（丙二醛（malonaldehyde，MDA））的含量以評價氧化應激的水平。

本研究以紫甘薯為原料，通過高速逆流色譜技術分離獲得一種水溶性多糖，通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分別鑒定其單糖組成和糖苷鍵構型；利用HO構建細胞氧化應激模型，以評估紫甘薯多糖的抗氧化特性；同時通過代謝組學闡釋紫甘薯多糖抗氧化的代謝機制，以期為紫甘薯多糖的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘薯（‘徐紫薯8號’）采自江蘇徐州，洗凈、切塊、低溫烘干備用。

鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）、半乳糖（galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）（純度均大于98%） 上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇、氯化鈉（均為色譜純）和其余試劑（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；100T-500T ROS測定試劑盒（化學熒光法）、CAT測定試劑盒（可見光法）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定試劑盒等均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

AB Triple 4600高分辨液相色譜-飛行時間質譜（liquid chromatography-time of flight mass chromatography，LC-TOF MS）、4500三重四極桿液相色譜串聯(lián)質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometer，LC-MS/MS） 美國AB SCIEX公司；7890A-5975C GC-MS儀 美國安捷倫科技公司；OptiChromeA-600高速逆流色譜儀 江陰逆流科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫甘薯多糖提取

稱取風干紫甘薯塊1 kg，以料液比1∶10（/）加入蒸餾水超聲提取30 min，過濾，反復操作3 次，合并提取液。調節(jié)pH值為4，向提取液中加入終質量分數(shù)2%纖維素酶（10 000 U/g），室溫水解2 h，然后加入終質量分數(shù)2%酸性蛋白酶解液（≥45 U/mg）繼續(xù)水解1 h。減壓旋蒸濃縮多糖提取液至原有體積的1/3后加入一定體積的體積分數(shù)95%乙醇溶液至乙醇終體積分數(shù)為75%，靜置過夜，3 000 r/min下離心，棄去上清液得沉淀。65 ℃水浴減壓濃縮除去乙醇，加超純水溶解，冷凍干燥獲得紫甘薯粗多糖（polysaccharide from purple sweet potato，PSPP）。利用Sevag法去除PSPP中的蛋白質：取PSPP溶于蒸餾水中（1∶10，/），按體積比4∶1加入氯仿-正丁醇混合溶液（4∶1，/），混合后，轉移至分液漏斗中，振蕩、靜置、分層，取上層水相溶液按體積比繼續(xù)加入氯仿-正丁醇混合溶液后萃取。反復3～4 次，直至上層溶液在250～280 nm波長處無吸收峰，冷凍干燥獲得去除蛋白的PSPP。

1.3.2 紫甘薯多糖的分離純化

配制甲醇-甲基叔丁基醚-水混合溶液（3∶1∶2，/），靜置過夜，下層為流動相，上層為固定相。使用高壓泵將上層相以1 mL/min的速率泵入高速逆流色譜儀中，當出口出現(xiàn)液體后，開啟高速逆流色譜儀，轉速為10 000 r/min，轉向為正向，柱溫30 ℃。利用高壓泵將下層相泵入高速逆流色譜儀中（1 mL/min）中，穩(wěn)定60 min。取1 g凍干PSPP，使用5 mL下層相溶劑溶解，使用針泵注入PSPP溶液，開啟自動接收器，使用示差檢測器進行監(jiān)測。取吸收峰對應的接受試管樣品，冷凍干燥，分別獲得純化多糖PSPP01、PSPP02、PSPP03和PSPP04。采用DPPH自由基清除能力測定試劑盒測定DPPH自由基清除率，篩選抗氧化活性最大的多糖，結果顯示只有PSPP03具有較明顯的DPPH自由基清除活性，故以PSPP03進行后續(xù)實驗。

1.3.3 PSPP03分子質量測定及傅里葉變換紅外光譜分析

利用高效液相凝膠色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法進行分子質量分析，色譜柱為OHpak SB-804HQ柱（8.0 mm×300 mm，10 μm），流動相為0.1 mol/L NaSO，流速為0.5 mL/min，柱溫35 ℃，采用示差檢測器檢測。以分子質量為4 300、20 000、44 100、63 000 Da和123 500 Da的葡聚糖為標準品，以保留時間和葡聚糖標準品分子質量的對數(shù)進行擬合，得到線性回歸方程，根據(jù)標準曲線方程計算PSPP03的分子質量。

采用傅里葉變換紅外光譜對多糖結構信息進行表征：取約10 mg樣品按質量比1∶200加入溴化鉀，充分研磨后，放入壓片機壓片。使用傅里葉變換紅外光譜儀進行分析，掃描范圍500～4 000 cm（步長為1 cm）。

1.3.4 PSPP03單糖組成分析

PSPP03單糖組成分析參照文獻[19]進行。取500 mg PSPP03加入安瓿瓶中，加入5 mL鹽酸-甲醇溶液（2 mol/L），在氮氣保護下置于80 ℃金屬浴中水解15 h，氮氣吹干，加入5 mL三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液（2 mol/L），升溫至120 ℃，繼續(xù)水解2 h。冷卻，過濾除去不溶物，減壓旋轉蒸發(fā)濃縮除去TFA，加水洗滌，再旋轉蒸發(fā)濃縮，反復3 次，向最后一次濃縮產物加入2 mL蒸餾水，溶解即得完全水解產物PSPP03-B，待用。

使用HPLC分析單糖組成，流動相為體積分數(shù)0.05%甲酸-水溶液，流速0.5 mL/min，色譜柱為Repromer Ca（250 mm×8 mm，9 μm），柱溫40 ℃，使用示差檢測器進行監(jiān)測。采用相同的方法分析Man、GlcA、Rha、Glc、Gal、Ara標準品。

使用0.5 mol/L的TFA溶液對PSPP03進行不完全水解（料液比為1∶20），用超純水透析（截留分子質量50 000 Da），透析后取透析袋內樣品（PSPP03-B）用2 mol/L的TFA溶液進行水解（料液比為1∶20），按照上述方法測定單糖組成，以確定主鏈單糖和側鏈單糖組成。

1.3.5 PSPP03甲基化組成分析

取500 mg PSPP03于反應瓶中，加入2 mL干燥的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，溶解后加入20 mg干燥的NaOH，超聲1 h使NaOH完全溶解，冰浴30 min，加入1 mL干燥的碘甲烷，在氮氣的保護下，超聲處理反應液1 h。加入蒸餾水終止甲基化反應。加入1 mol/L乙酸溶液中和反應。用超純水對反應液進行透析（截留分子質量50 000 Da）至袋內顏色透明，冷凍干燥。將甲基化的多糖樣品溶于體積分數(shù)90%甲酸溶液，密封后110 ℃解聚反應6 h。反應結束后減壓蒸干，分別加入3 mL甲醇重復蒸干5 次。轉移樣品于含有2 mol/L TFA溶液的安瓿管中，封管后110 ℃水解反應2 h，隨后減壓蒸干。再加入3 mL蒸餾水充分溶解樣品，隨后加入30 mg NaBH還原乙酰化后制得甲基化的乙酸衍生物，使用氯仿萃取，回收氯仿層物質，減壓濃縮后進行GC-MS分析。

GC條件：毛細管柱為HP-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，程序升溫，起始溫度為80 ℃，以10 ℃/min升至260 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離離子源，離子源溫度280 ℃，氦氣流速1 mL/min。

1.3.6 多糖中花青素鑒定及活性檢測

取適量PSPP03，按質量體積比1∶2加入水溶解，超聲輔助溶解，過濾，清液轉移至DEAE-52大孔樹脂柱內，使用體積分數(shù)20%～60%的乙醇溶液進行洗脫，分別收集有色段（花青素）和無色段洗脫液。將用斐林試劑檢測出含有多糖的無色段洗脫液合并，冷凍干燥獲得去除花青素的多糖PSPP03-E。有色段濃縮后，使用氮氣吹干儀進行處理，獲得有色段物質PSPP03-P，PSPP03-P使用體積分數(shù)0.5%甲酸-甲醇溶液溶解后，利用LC-MS/MS進行分析。利用矢車菊素-3葡萄糖為內標（標準曲線方程：＝417 726-108 870，＝0.999 7）進行定量計算。

質譜條件：正離子模式全掃描和自動二級離子掃描，掃描范圍為100～1 200/，載氣為干燥氮氣，離子源溫度550 ℃，霧化氣壓力55 psi，渦輪增壓氣壓力55 psi，氣簾氣壓力25 psi，全掃描分析。

液相色譜條件：選用ACQUITY UPLC HSS T3 C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相A為體積分數(shù)5%甲酸-水溶液，B為體積分數(shù)5%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫為0～8 min 97% A，8～30 min 92% A，30～35 min 80% A，35～40 min 75% A，隨后流動相A體積分數(shù)升至97%，穩(wěn)定5 min。

為探究PSPP03結構對抗氧化能力的影響，采用DPPH自由基清除能力測定試劑盒分析PSPP03-E和PSPP03-P的抗氧化活性。

1.3.7 細胞培養(yǎng)、造模和給藥處理

HepG2細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基+10%（質量分數(shù)，后同）胎牛血清+1%鏈霉素-青霉素溶液），取對數(shù)生長期的HepG2細胞，接種至6 孔板中，24 h細胞貼壁情況良好、覆蓋率為80%時給藥。

實驗分組：對照組（CK）為正常培養(yǎng)細胞；造模組（HO處理組）為體積分數(shù)30% HO溶液孵育6 h；給藥組（HO+PSPP03）為不同質量濃度（25 μg/mL和100 μg/mL，根據(jù)DPPH自由基清除率所選擇）PSPP03預處理24 h，再用HO孵育6 h。

1.3.8 細胞活力測定

采用噻唑藍（thiazolyl blue，MTT）法測定細胞活力，取1.3.7節(jié)培養(yǎng)細胞，每孔加入5 g/L MTT處理4 h，棄掉上清液，加入DMSO重懸，振蕩10 min溶解沉淀，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度。細胞存活率按下式計算，設置6 個平行。

1.3.9 ROS及抗氧化酶活力測定

按1.3.7節(jié)培養(yǎng)細胞，使用ROS測定試劑盒（化學熒光法）測定ROS水平。同理，MDA、SOD、CAT、GSH-Px和還原型/氧化型谷胱甘肽（reduced glutathione/oxidized glutathione，GSH/GSSG）等水平均采用相應試劑盒進行測定。

1.3.10 代謝組學分析

取1.3.7節(jié)培養(yǎng)細胞并離心，沉淀中加入適量甲醇-丙酮（1∶1，/）混合溶液，超聲提取30 min，12 000 r/min冷凍離心15 min，取上清液，使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干，使用0.5 mL甲醇溶解殘余物，過0.22 μm濾膜，進LC-MS/MS分析。

色譜條件：選用ACQUITY UPLC HSS T3 C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液，流動相B為體積分數(shù)0.1%乙腈-水溶液。梯度洗脫：0～5 min，5% B；5～10 min，5%～90% B；10～15 min，90% B；11 min，5% B。流速0.5 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫35 ℃。

質譜條件：電噴霧電離離子源，正離子模式，碰撞能量（40±15）eV，電壓5 500 V，離子源溫度600 ℃，霧化氣壓力55 psi，渦輪增壓氣壓力55 psi，氣簾氣壓力25 psi，全掃描分析，質量掃描范圍55～1 000 Da，一級質譜采集頻率為0.25 s，二級質譜采集頻率0.1 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用GraphPrism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素分析法進行顯著性分析，以＜0.05表示差異顯著。

代謝組學數(shù)據(jù)采用Peakview軟件對采集的譜圖進行峰提取，利用Markview軟件對原始數(shù)據(jù)進行預處理。得到的數(shù)據(jù)集導入SIMCA 13.0軟件進行主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，獲得差異代謝物。根據(jù)差異代謝物的碎片信息，在人類代謝組數(shù)據(jù)庫（The Human Metabolome Database，HMDB）中進行比對，最終鑒定出差異代謝物。將差異代謝物導入MetaboAnalyst 5.0軟件檢索出富集代謝通路。

2 結果與分析

2.1 紫甘薯多糖分離純化及鑒定結果

圖1A為PSPP高速逆流色譜分離圖，可以看出，PSPP在高速逆流色譜上共有4 個明顯分離的峰。每個色譜峰分離度較好，表明可以利用高速逆流色譜對紫甘薯多糖進行一步分離、純化。通過收集各色譜峰樣品，對各色譜峰樣品進行抗氧化活性測試，如圖1B所示，PSPP03抗氧化活性最好，DPPH自由基清除率達到（92.27±5.03）%，接近PSPP的DPPH自由基清除率（（95.05±6.77）%）。同質量濃度下，PSPP03 DPPH自由基清除率顯著高于VC（＜0.05），其他3 個多糖DPPH自由基清除率都不足10%，因此選取PSPP03作為后續(xù)研究的多糖樣本。

圖1 紫甘薯多糖分離純化及鑒定結果Fig. 1 Isolation and identification of polysaccharides from purple sweet potato

2.2 PSPP03分子質量測定結果

使用不同分子質量的葡聚糖作為標準品，利用HPGPC得到線性回歸方程為lg=1.257 1-4.092 7（＝0.997 2）。將PSPP03在HPGPC中的保留時間代入線性回歸方程，計算得到分子質量為29.1 kDa。通過圖1C可知，PSPP03在HPGPC上吸收峰相對狹窄且對稱，說明PSPP03分子質量分布相對均一，為均一組分。

2.3 PSPP03傅里葉變換紅外光譜分析結果

PSPP03的傅里葉變換紅外光譜如圖1D所示，3 435 cm處是—OH的伸縮振動峰，1 615 cm處吸收峰可能歸屬于糖醛酸中C＝O基團，1 413 cm處吸收峰則可能是由多糖中甲基的彎曲振動所引起，同時1 040 cm處吸收峰由C—O—C的伸縮振動引起，提示PSPP03組分中存在吡喃糖環(huán)。綜上，PSPP03在紅外譜圖中存在多糖的特征吸收峰，且可能為酸性多糖。

2.4 PSPP03單糖組成

利用HPLC分析PSPP03完全水解產物和不完全水解的產物PSPP03-B，結果如圖2所示，PSPP03主要是由-Ara、-Man、-Rha、-GlcA和-Glc組成，物質的量比為16.2∶25.3∶7.1∶8.6∶10.8。PSPP03不完全水解后單糖主要為-Ara、-Man、-Rha和-Glc，物質的量比為10.6∶24.76∶6.6∶6.2，表明PSPP03主鏈主要是由這4 種單糖組成，側鏈主要以-GlcA和部分-Ara和-Glc組成。

圖2 PSPP03單糖組成HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram showing monosaccharide composition of PSPP03

2.5 PSPP03甲基化分析結果

甲基化分析是一種檢測多糖主鏈中糖苷鍵類型的有效方法。利用GC-MS對PSPP03甲基化產物進行分析，通過比對保留時間和質譜碎片信息，如表1所示，PSPP03結構中主要有7 種連接類型，包括→4)-Ara-(→1、→3)-Man-(1→、→3,4)-Man-(1→、→3,6)-Man-(1→、→3)-Glc-(1→、Glc-(1→和→4)-Rha-(1→，通過計算，上述7 種連接類型的物質的量比為21.34∶16.24∶2.65∶15.61∶15.61∶10.08∶11.75。根據(jù)單糖組成、物質的量比和甲基化物質的量比的結果，推測Glc-(1→可能是GlcA完全甲基化后被還原的產物。因此，結合單糖組成分析，PSPP03的主鏈主要連接類型可能有→4)-Ara-(→1、→3)--Man-(1→、→3,4)--Man-(1→、→3,6)--Man-(1→、→3)--Glc-(1→和→4)--Rha-(1→，而側鏈的連接形式可能主要為-Glc-(1→以及→4)--Ara-(→1和→3)--Glc-(1→。

表1 PSPP03甲基化組成分析結果Table 1 Methylation results of PSPP03

2.6 PSPP03中花青素分析結果

根據(jù)多糖和花青素結構特點，花青素結構中的羥基易與多糖中羥基通過氫鍵進行結合。利用LC-MS/MS對PSPP03中花青素組分進行鑒定，結果如表2所示。PSPP03共鑒定出4 個花青素組分，分別為矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖、芍藥素-3-槐糖苷-5-葡萄糖、矢車菊素-3-羥基苯甲酰槐糖苷-5-葡萄糖和矢車菊素-3-(6’’’-咖啡酰槐糖苷)-5-葡萄糖。通過內標定量計算后，4 種花青素在PSPP03中的含量分別為14.68、12.62、2.85 μg/100 mg和6.82 μg/100 mg。結果表明，PSPP03結構中存在一定含量的花青素，其主要成分為矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖和芍藥素-3-槐糖苷-5-葡萄糖。

表2 PSPP03中花青素鑒定及含量Table 2 Identification and concentrations of anthocyanins in PSPP03

2.7 PSPP03對HepG2細胞抗氧化酶活力及非酶抗氧化物質的影響

對不同質量濃度PSPP03的DPPH自由基清除率進行測定，結果如圖3A所示。DPPH自由基清除率隨著PSPP03質量濃度增加而增加，當質量濃度為100 μg/mL時，DPPH自由基清除率達到了（94.05±18.12）%，PSPP03質量濃度為25 μg/mL時，DPPH自由基清除率為（55.62±8.03）%，半抑制質量濃度為22.19 μg/mL。因此后續(xù)細胞氧化損傷測試選擇用PSPP03的25 μg/mL和100 μg/mL兩個質量濃度。

圖3B為不同處理組（CK、HO組、HO+25 μg/mL PSPP03和HO+100 μg/mL PSPP03）HepG2細胞的存活率。可以看出，PSPP03可以極顯著提高細胞的HO耐受性，提高細胞存活率。當使用25 μg/mL PSPP03孵育細胞時，細胞存活率為（68.73±8.14）%，而HO處理組細胞存活率僅為（27.84±6.97）%。當PSPP03質量濃度為100 μg/mL時，細胞存活率為（94.17±4.50）%，與CK組并無顯著差異。結果表明，PSPP03可以有效提高細胞在HO氧化作用下的細胞存活率，提示PSPP03具有良好的細胞抗氧化活性。

細胞內ROS、GSH和MDA水平反映了細胞內氧化程度，SOD、GSH-Px等酶活力反映細胞內抗氧化能力。圖3C～F為PSPP03對細胞內抗氧化酶活力及非酶抗氧化物質（如GSH等）含量的影響。

從圖3C可以看出，HO處理后，細胞內的ROS水平激增至CK組的4 倍（＜0.01）。當加入PSPP03進行細胞孵育后，細胞內的ROS含量極顯著低于HO處理組，且與質量濃度呈正相關，當質量濃度為25 μg/mL時，ROS相對水平是HO處理組的39.11%（＜0.01），質量濃度為100 μg/mL時，ROS相對水平是HO處理組的24.59%（＜0.01），接近CK組，說明PSPP03可以降低或者清除因HO引起的細胞內ROS積累。

圖3D為PSPP03對細胞內CAT和SOD相對活力的影響，HO處理后，SOD和CAT的活性被抑制，相對活力僅分別為CK組的35.42%和38.89%（＜0.01）。與HO處理組相比，當加入PSPP03后，質量濃度為25 μg/mL和100 μg/mL時CAT相對活力分別增加了1.28 倍和1.71 倍（＜0.01），SOD活力分別增加了1.65 倍和2.00 倍（＜0.01）。CAT在細胞內的主要作用是通過分解HO減輕細胞氧化損傷。SOD在人體內起氧化平衡作用，主要是通過清除細胞內的超氧陰離子自由基來保護細胞免受氧化損傷。

圖3E為PSPP03對細胞內GSH-Px相對活力和GSH相對含量的影響，經HO處理后，細胞內GSH-Px相對活力極顯著下降（＜0.01），活力下降至CK組的16.44%，GSH含量也下降到CK組的30.76%。加入PSPP03后，GSH-Px相對活力極顯著提高（＜0.01），質量濃度為25 μg/mL和100 μg/mL時分別提高了3 倍和7 倍。表明PSPP03可以通過提高細胞內GSH-Px活性催化細胞內過氧化物分解，減輕細胞所受過氧化物的損傷。GSH是細胞中重要的非酶類抗氧化物質之一，其主要作用是維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定和抗氧化。本研究中，GSH相對含量在PSPP03作用后較HO處理組有所增加。GSH在細胞內主要通過淬滅自由基和清除過氧化物來減輕細胞氧化程度，其含量反映細胞氧化程度。GSH轉化過氧化物過程需要GSH-Px的催化，本研究中HO處理會降低GSH-Px的活性，因此會造成細胞內GSH無法轉變?yōu)镚SSG，從而導致細胞內過氧化物積累。加入PSPP03后，一方面提高了GSH-Px活力，促進了GSH的催化形成；另一方面，PSPP03可能通過觸發(fā)GSH合成代謝通路，從而促進GSH的轉化或生成。

MDA是細胞內脂類物質分解的最終產物，MDA的積累會導致細胞代謝受阻，造成細胞功能障礙，甚至死亡。GSSG是GSH的氧化產物，GSSG與MDA的含量都能夠反映細胞的氧化損傷程度。PSPP03對細胞內MDA相對含量的影響如圖3F所示，HO作用后，細胞內MDA相對含量是CK組的2.32 倍（＜0.01）；當PSPP03作用后，MDA含量出現(xiàn)下降趨勢，且下降程度與PSPP03質量濃度成正比，25 μg/mL和100 μg/mL時，MDA相對含量分別下降到HO處理組的54.67%和41.06%（＜0.01）。GSSG相對含量變化趨勢與MDA相似，HO處理會促使細胞內GSSG含量激增，上升到CK組的6.21 倍（＜0.01）。當PSPP03處理后，GSSG相對含量在25 μg/mL和100 μg/mL PSPP03作用下分別下降到HO處理組的32.64%和20.00%（＜0.01）。結果提示，PSPP03可以有效減少HO作用下細胞內MDA和GSSG的積累，降低細胞的氧化損傷。

對去除花青素后的多糖（PSPP03-E）進行抗氧化活性分析，結果如圖4所示，去除花青素后，PSPP03-E抗氧化活性較未處理PSPP03下降了9.48%（＜0.05），活性下降幅度較小。對洗脫掉的花青素（PSPP03-P）進行DPPH自由基清除活性測定，結果表明，PSPP03-P活性與未處理PSPP03相比DPPH自由基清除率下降了26.50%（＜0.01）。通過比較可知，PSPP03的抗氧化活性主要來源于多糖部分，結合的花青素對抗氧化活性影響相對較小。

研究表明，多糖的結構與抗氧化活性有直接關系。吡喃型結構一般被認為是多糖抗氧化的重要結構因素，根據(jù)表1質譜數(shù)據(jù)對比數(shù)據(jù)庫可知本研究中獲得多糖中Man、Rha、Glc構型均為吡喃型。同時PSPP03中存在一定量的花青素（表2），研究表明花青素具有較強的抗氧化性。本研究中，洗脫后的花青素抗氧化活性仍超過60%，說明花青素的存在對PSPP03抗氧化性也有一定的貢獻。

多糖可以通過清除DPPH自由基和ROS以及提高抗氧化酶活性達到抗氧化的目的。如Fang Zhiyu等發(fā)現(xiàn)南瓜多糖可以通過清除ROS和提高CAT活性達到抗氧化的目的。此外，多糖還可以降低細胞非酶系氧化物質，如MDA、GSSG等水平，從而減輕氧化損傷程度。如朱慧民等發(fā)現(xiàn)紅豆沙多糖能夠通過降低MDA含量從而減輕心肌缺血-再灌注損傷小鼠模型中心肌細胞的氧化損傷。本研究中，從紫甘薯中分離獲得的多糖PSPP03可以有效地提高細胞內抗氧化酶系活性，同時能夠影響非酶系抗氧化物質的水平，減輕HO對細胞的損傷。

圖3 基于細胞氧化損傷模型的PSPP03抗氧化活性Fig. 3 Antioxidant activity of PSPP03 in cell model of oxidative damage

圖4 PSPP03洗脫花青素前后的抗氧化能力Fig. 4 Antioxidant capacity of PSPP03 before and after removal of anthocyanins

2.8 PSPP03抗氧化代謝機理

對模型細胞代謝物進行提取、分析，經過軟件歸一化和轉化后，導入軟件進行主成分分析，結果如圖5A所示。4 組細胞代謝物樣本在組內聚集，而組間有明顯的距離，表明該模型建立良好，能很好地預測結果。根據(jù)圖5A進行分析，PSPP03兩個給藥組和HO處理組對主成分1影響顯著，且從距離判斷，給藥組對主成分1的影響要強于HO處理組。

圖5 基于代謝組分析PSPP03對H2O2誘導的氧化損傷細胞代謝譜的變化Fig. 5 Metabolomics analysis of changes in metabolic profile of cells induced by PSPP03 and H2O2

根據(jù)質譜數(shù)據(jù)，對4 組樣品中的代謝物進行鑒定，結果如表3所示，根據(jù)顯著性共鑒定出23 個具有顯著性差異（＜0.05且VIP＞1.5）的差異代謝物，其中17 個差異代謝物上調，6 個差異代謝物下調。根據(jù)鑒定的化合物種類，PSPP03處理引起的細胞內差異代謝物質主要分為2 類：一類為碳水化合物；另一類為氨基酸。利用MetaboAnalyst軟件進行代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)PSPP03主要可以影響細胞的糖代謝（三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝和糖異生）和氨基酸代謝途徑。圖5B為PSPP03作用下氧化損傷細胞內23 種差異代謝物的聚類熱圖，可以明顯看出高質量濃度PSPP03給藥組可以顯著提高部分代謝物的相對含量，如檸檬酸和絲氨酸。檸檬酸是三羧酸循環(huán)中重要的中間產物，通過代謝通路的影響分析，三羧酸循環(huán)在PSPP03給藥后受到顯著影響（圖5C、D）。三羧酸循環(huán)可以影響氨基酸代謝，如精氨酸合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等。此外，PSPP03還對絲氨酸的合成與代謝起到促進作用，絲氨酸在細胞內可以通過谷氨酸半胱氨酸連接酶的作用轉化為谷胱甘肽，對抗氧化具有重要的作用。同時，差異代謝物中，還存在3 個嘌呤代謝相關的化合物——肌苷一磷酸、鳥嘌呤核苷5’-磷酸和腺苷。這3 種代謝物與細胞內ATP能量代謝具有一定的關聯(lián)，提示PSPP03對細胞中的三羧酸循環(huán)也可能具有一定的影響。

表3 基于LC-MS鑒定PSPP03給藥組和H2O2處理組差異代謝物Table 3 Identified differential metabolites between PSPP03- and H2O2-treated cells

為驗證代謝組結果，挑取6 種差異代謝物利用LC-MS/MS進行精確定量，結果如表4所示。經過PSPP03給藥后，25 μg/mL給藥組中各指標丙酮酸、檸檬酸、絲氨酸和脯氨酸物質的量分別是HO處理組的1.38、1.33、2.03、1.67 倍，100 μg/mL給藥組中各指標物質的量分別是HO處理組的1.49、1.39、3.55、1.84 倍。而腺苷和GSSG在25 μg/mL PSPP03給藥條件下分別下降到HO處理組的58.45%和49.92%，100 μg/mL PSPP03條件下分別下降到HO處理組的22.48%和21.14%。

表4 基于LC-MS/MS對部分差異代謝物進行定量分析Table 4 Quantitative analysis of differential metabolites by LC-MS/MS mmol

3 結 論

本研究從紫甘薯中分離獲得4 個純多糖，DPPH自由基清除能力分析結果表明PSPP03具有顯著的抗氧化潛力。

利用HPLC技術對PSPP03的結構進行了初步分析，其主要由-Ara、-Man、-Rha、-GlcA和-Glc組成，物質的量比為16.2∶25.3∶7.1∶8.6∶10.8。甲基化分析結果表明其主鏈連接主要構型為→4)--Ara-(→1、→3)--Man-(1→、→3,4)--Man-(1→、→3,6)--Man-(1→、→3)--Glc-(1→和→4)--Rha-(1→，而側鏈的連接形式可能主要為-Glc-(1→以及→4)--Ara-(→1和→3)--Glc-(1→。PSPP03中含有一定量的花青素，主要成分為芍藥素-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷和矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷，其可能主要以氫鍵形式結合。通過分析比較抗氧化性可知，PSPP03的抗氧化活性主要來源于多糖部分。

利用HO誘導建立氧化損傷細胞模型，探究了PSPP03細胞抗氧化能力。結果表明PSPP03可以顯著降低細胞內ROS水平，減輕氧化損傷程度；同時顯著提高SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活力和GSH水平；顯著降低GSSG和MDA等有害物質含量。

代謝組學分析結果表明，PSPP03細胞內抗氧化代謝機制有可能是通過促進相關氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)從而減輕細胞的氧化損傷。