三江源地區熊蜂物種多樣性研究

梁程博， 王久利， 孫 國， 馮 收， 卓平桂， 劉道鑫， 閆京艷*

(1.青海大學農牧學院， 青海 西寧 810016； 2.青海民族大學生態環境與資源學院， 青海 西寧 810007；3.青海大學昆侖學院， 青海 西寧 810016)

熊蜂(Bombusspp.)隸屬于節肢動物門(Arthropoda)昆蟲綱(Insecta)膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂科(Apidae)熊蜂屬(Bombus)，是一類社會性傳粉昆蟲[1]。其在維護生態系統平衡中發揮重要作用[2]，是眾多野生植物，尤其是高山植物和高原植物的重要傳粉者[3-6]。中國對熊蜂區系的研究起步較晚，20世紀70年代前，有關中國的熊蜂區系研究主要由西方學者進行；20世紀70年代后，中國科學院動物研究所等單位開展了一系列科考活動并報道了中國部分地區的熊蜂物種名錄；近20年來，中國農業科學院蜜蜂研究所牽頭開展了中國熊蜂資源本底調查。黃家興等[7]對中國熊蜂多樣性進行了研究，報道了125種熊蜂，占全球熊蜂資源的50%，認為中國是熊蜂物種資源最豐富的國家；但目前，中國西部的部分地區仍缺少熊蜂多樣性研究(圖1)，其中包括重要的生態功能區——三江源地區。

圖1 中國熊蜂調查樣點分布Fig.1 Distribution sites of the bumblebees of China注：基于中國農業科學院蜜蜂研究所2002—2017年采集的標本[7]Note:Based on the records of the collection of Institute of Apicultural Research of China Academy of Agricultural Science between 2002—2017

三江源地區是長江、黃河和瀾滄江重要的水資源供給地[8-10]，是世界高寒生物資源庫[11]，也是我國江河中下游地區和東南亞國家生態環境安全和區域可持續發展的生態屏障[12]。因其惡劣的生態環境，當地傳粉昆蟲種類少，尤其在高寒草地生態系統中，許多植物都嚴重依賴熊蜂授粉[2]。了解熊蜂分布情況是對其進行保護和利用，進而保護生態環境的基礎。

本研究對三江源地區熊蜂組成情況進行了調查與分析，為系統地認識該地區熊蜂組成情況和更完善地了解中國熊蜂資源提供了資料，為三江源地區傳粉昆蟲資源保護和生態平衡維持提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年至2021年每年的7月至8月，在三江源地區(北緯31°32′至36°16′，東經89°23′至99°20′內)的瑪多縣、玉樹市、治多縣、囊謙縣、稱多縣、雜多縣和曲麻萊縣7個行政區進行樣品采集。行政區劃分及本文所繪地圖均基于國家基礎地理信息中心(http://www.ngcc.cn/ngcc/)審圖號為GS(2016)2556的標準公益性地圖。在每個采樣點的采集范圍約1 km2，采集時間約1 h。采集時，用捕蟲網采集熊蜂后，將其放入礦泉水瓶中，待其死亡。將死亡的熊蜂進行統一編號后，針插并放入標本盒保存。共在84個樣點采集到1 467頭熊蜂(樣點分布見圖2)。

圖2 采樣點分布Fig.2 The sampling points distribution

1.2 樣品鑒定

首先，通過毛色、上顎和后足脛節等形態學鑒別特征對樣品進行形態學鑒定[1,13-15]，依據鑒定結果將全部樣品分亞屬、種歸類存放。而后每種選取1～3頭進行分子生物學鑒定。分子生物學鑒定基于16S rDNA和COI基因的序列分析。首先，視樣品體型取右后足或右側后足與中足，碾碎，用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(上海生物工程有限公司)提取DNA。而后，對其線粒體16S rDNA(引物：F-5′-CACCTGTTTATCAAAAAC-AT-3′； R-5′-TATAGATAGAAACCAATCTG-3′)和COⅠ(引物：F-5′-GGTCAACAAATCATAAAGATA-TTGG-3′；R-5′-TAAACTTCAGGGTG-ACCAAAAAATCA-3′)基因進行PCR擴增。反應體系均為40 μL，其中DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，10×Buffer (Mg2+) 5 μL，dNTPs混合物2.5 μL，Tap酶0.5 μL，ddH2O 29 μL。兩序列的擴增條件除退火過程不同外(16S rDNA：59℃，40 s；COⅠ：47.9℃，40 s)，其他均相同，為95℃預變性4 min，95℃變性40 s，72℃延伸45 s，72℃總延伸6 min；循環均為45次。利用瓊脂糖凝膠電泳對擴增效果進行檢測，確定擴增出目標條帶且無雜帶后將擴增產物送至上海生工生物工程有限公司進行Sanger測序。結合峰圖用MEGA v7進行校對，將校對后的序列在GenBank中進行在線BLAST。結合形態學鑒定和BLAST結果進行最終鑒定。

1.3 物種多樣性特征分析

根據鑒定結果，統計各樣點和行政區的熊蜂物種組成情況。利用相對多度(Ra)、Berger-Parker優勢度指數(D)、Margalef物種豐富度指數(Rs)、物種豐富度(S)、Shannon-Wiener多樣性指數(H′)和Pielou均勻度指數(E)分析三江源地區及其中各行政區的熊蜂物種多樣性特征。利用物種相似性系數和相同物種數比較各行政區間熊蜂組成的差異情況。根據梁鋮[16]的標準，對三江源地區熊蜂優勢種進行判定，判定標準為Ra≥ 10%者為優勢種，5% ≤Ra< 10%者為豐盛種，1% ≤Ra< 5% 者為常見種，0.1% ≤Ra< 1%者為偶見種，Ra< 0.1%者為稀有種。上述多樣性指數計算公式如下所示。

1)相對多度Ra

Ra=Na/N×100%

式中Na為物種a的個體數；N為所有物種的個體數。

2)Berger-Parker優勢度指數(D)

D=Nmax/N

式中Nmax為優勢種的個體數；N為全部種類的個體數。

3)Margalef物種豐富度指數(Rs)

Rs=(S-1)/lnN

式中S為物種數；N為全部物種的個體總數。

4)Shannon-Wiener指數(H′)

式中S為物種數；Pi為第i種個體占總個體數的比例。

5)Pielou物種均勻度(E)

式中S為物種數；Pi為第i種個體占總個體數的比例。

6)物種相似性系數(Cs)

式中c表示兩個生境中共有物種數；a，b表示兩個生境中分別所具有的物種數。

2 結果與分析

2.1 鑒定結果

本研究共鑒定21種熊蜂，涉及9個亞屬(表1)。布氏熊蜂的16S和COⅠ等DNA條碼數據暫未公布；本研究中的布氏熊蜂得到了形態學鑒定支持，其雌性標本的后足脛節不形成花粉框，生殖基節具“V”字型側龍骨突，屬擬熊蜂亞屬；加上其它形態特征[14]，可以確定樣品為布氏熊蜂。同時其16S rDNA的測序結果和同屬于擬熊蜂亞屬Psithyrus的崖熊蜂B.rupestris(NCBI登錄號DQ788099)的比對相似度最高，為96.42%，初步驗證了形態鑒定結果。另有一個種的形態鑒定結果與已記錄熊蜂的形態特征均不同，且與GenBank中已知熊蜂參考序列的比對一致性均低于96%，本研究暫定為未知種(B.sp.SJY-2019)。根據形態特征，B.sp.SJY-2019被鑒定為屬于擬熊蜂亞屬；同時，其16S rDNA和COI分子標記的測序結果分別和屬于擬熊蜂亞屬Psithyrus的角熊蜂B.cornutus(NCBI登錄號EF032353) 和圖氏熊蜂B.turneri(NCBI登錄號KX791753) 相似度最高，分別為95.19%和95.71%，即形態學和分子鑒定結果均支持B.sp. SJY-2019屬于擬熊蜂亞屬。因本研究只獲得了少量B.sp. SJY-2019的蜂王標本，所以未能對該種進行明確的形態學描述。本研究中川熊蜂的鑒定得到了COI分子標記的支持，形態特征與已記錄的川熊蜂特征僅存在少許差異；本研究中，標本4，5腹節背面毛色均為橙色，而已有的記錄為白色(圖3)；鑒于COI分子比對中較高的序列相似度(與NCBI中KP671623序列相似度為99.36%)且其他形態特征符合，本研究將其鑒定為川熊蜂。其他熊蜂的16S rDNA鑒定、COI基因鑒定和形態學鑒定的結果均一致，即分子鑒定結果與形態學鑒定結果相互支持。

表1 三江源地區熊蜂分布情況Table 1 Bumblebees composition in Sanjiangyuan region

續表1

圖3 川熊蜂俯視圖Fig.3 Planform of B. sichuansis注：(a)為本研究標本照片；(b)為已記錄的示意圖[1]Note:(a),the photographs of specimens in this study;(b),the recorded schematics diagram

2.2 物種多樣性特征

根據形態和分子物種鑒定結果，各采樣點和行政縣/市的熊蜂物種組成如表1和圖4所示，代表性采集點見表2。在分布范圍方面，克什米爾熊蜂、越熊蜂、川熊蜂、拉達克熊蜂、紅束熊蜂和穩紋熊蜂在7個行政區均有分布，其中，克什米爾熊蜂和穩紋熊蜂均為三江源地區的優勢種(相對多度Ra≥ 10%)，越熊蜂、川熊蜂、拉達克熊蜂和紅束熊蜂均為豐盛種(5% ≤Ra< 10%)。偽猛熊蜂也是豐盛種，但在囊謙未見其分布。蘇氏熊蜂、布氏熊蜂、黑尾熊蜂、B.tibeticus和盜熊蜂為常見種(1% ≤Ra< 5%)，分別在3～6個行政區有分布。密林熊蜂、弗里熊蜂、斯科熊蜂、B. sp. SJY-2019、西伯熊蜂、猛熊蜂和興熊蜂為偶見種(0.1% ≤Ra< 1%)，分別分布于1～4個行政區。凸污熊蜂和亞洲熊蜂均為稀有種(Ra< 0.1%)，均只有1個樣品被采集。一些種在三江源地區具較小的相對多度，但卻分布在較大的地理范圍內分布，如黑尾熊蜂的相對多度為1.5%，多于斯科熊蜂(Ra=0.34%)，但前者僅在治多縣、稱多縣和玉樹市3個行政區被發現，而后者在曲麻萊縣、玉樹市、雜多縣和位于三江源地區最南部的囊謙縣4個行政區均有分布。

圖4 各采樣點的熊蜂物種組成Fig.4 Bumblebees composition at each locality注：圖中各位點柱形長度與該位點采集熊蜂數成正比Note:The column length of each locality in the figure is proportional to the number of bumblebees collected at the locality

表2 代表性采集點Table 2 The representative collection localities

在7個行政區中，稱多縣的物種多樣性最高，其物種數、多樣性指數、豐富度指數和均勻度指數均高于其他行政區(表3)。曲麻萊縣的物種多樣性最低，物種數、個體數、多樣性指數和均勻度指數均低于其他行政區。在治多縣記錄到的個體數最多，但其豐富度指數和均勻度指數最低，而優勢度指數最高；這是因為該地區克什米爾熊蜂和穩紋熊蜂的數量多，其他物種數量少。克什米爾熊蜂和穩紋熊蜂是三江源地區的優勢種(相對多度Ra≥ 10%)，二者約四分之一的個體在治多縣被采集。

表3 各行政區熊蜂物種多樣性特征Table 3 Species diversity characteristic of bumblebees in each administrative region

物種相似度分析結果表明(表4)，雜多縣和玉樹市物種相似度系數最高(0.857 1)，兩地區有12個共有種；治多縣與囊謙縣的物種相似度最低(0.368 4)，兩地區僅7個共有種。在三江源地區內，地理距離較小的地區間可能具有較大的物種相似性，如稱多縣和曲麻萊縣相鄰，二者的物種相似性系數為0.388 9，共有種7個；而稱多縣和雜多縣被其他行政區相隔，二者的物種相似性系數為0.555 6，共有種10個。

表4 各行政區間相同物種數和相似性系數Table 4 Number of the shared species and the similarity coefficient among administrative regions

3 討論

3.1 三江源地區熊蜂組成

本研究在三江源地區共發現隸屬于9個亞屬的20種已知種和1種未知種，其中布氏熊蜂、斯科熊蜂和B. sp. SJY-2019為寄生性熊蜂，其它18種為社會性熊蜂。20種已知種中，有越熊蜂、凸污熊蜂、川熊蜂和B.tibeticus4種中國特有種[7]，有穩紋熊蜂、凸污熊蜂、偽猛熊蜂、越熊蜂、興熊蜂、克什米爾熊蜂、拉達克熊蜂、紅束熊蜂、斯科熊蜂和B.tibeticus10種青藏高原特有種[14-15]。

根據Williams等[14-15,17-19]、王保海等[20]、安建東等[13]和黃家興[1]的研究，青藏高原已記錄隸屬于11個亞屬的87種熊蜂，其中社會性熊蜂和寄生性熊蜂分別有79種和9種。三江源地區熊蜂物種數、社會性熊蜂物種數和寄生性熊蜂物種數均超過整個青藏高原的20%。本研究記錄的熊蜂，除未知種B.sp. SJY-2019外，其他種均已在青海有所記錄。與王保海等[20]的研究相比，本研究在雜多縣、囊謙縣、稱多縣和瑪多縣，新記錄到布氏熊蜂、盜熊蜂、弗里熊蜂、興熊蜂、克什米爾熊蜂、西伯熊蜂、斯科熊蜂、黑尾熊蜂、蘇氏熊蜂、B.tibeticus和川熊蜂。

利用傳統形態學方法鑒定雌性熊蜂時，需通過毛色特征對同亞屬的不同種進行區分。但此方法有時并不準確[1]。部分熊蜂存在體色多態性[21]，如本研究采集到的川熊蜂標本均與已記錄的川熊蜂存在毛色上的差異。同時，不同種熊蜂的毛色可能存在趨同，如B.sp. SJY-2019在毛色上與西藏熊蜂幾乎相同，這對熊蜂形態學鑒定和新種的發現造成了困難。進年來，幾何形態學在昆蟲分類上的應用得到了發展[22]，如Kozmus等[23]通過翅的結構對19種熊蜂進行了幾何形態學鑒定，鑒定準確度達到97%。尋找更多可用于幾何形態學鑒定的形態特征或許有利于更準確地進行熊蜂形態學分類。

3.2 三江源地區熊蜂物種多樣性水平

在多樣性指數、均勻度指數和物種豐富度方面，三江源地區略低于青藏高原其它地區和青藏高原毗鄰區。如位于青藏高原東部向黃土高原過度地帶的甘肅省，其Shannon-Wiener多樣性指數為3.03，Pielou均勻度指數為0.76，物種豐富度為56；位于青藏高原東側的青海省東部地區，其Shannon-Wiener多樣性指數、Pielou均勻度指數和物種豐富度分別為2.67，0.85和23.00[2]。這兩個地區的三個指標均高于三江源地區(Shannon-Wiener多樣性指數為2.15,Pielou均勻度指數為0.71,物種豐富度為21)。這可能因為青藏高原向黃土高原、秦嶺山地和四川盆地過渡的地帶是世界熊蜂多樣性中心，上述兩地區比三江源地區更接近多樣性中心[7]。而同其它高寒地區相比，三江源地區熊蜂多樣性處于較高水平，如Rasmont等[24]在庇里牛斯山脈的高寒地區僅發現7種社會性熊蜂，而本研究記錄到18種社會性昆蟲。從亞屬水平上看，三江源地區有9個亞屬，與中國其他地區相比具有較高的多樣性水平，如安建東等[13]通過對華北和西北部分地區熊蜂資源的研究發現，京津冀地區、山西省、內蒙古自治區、寧夏回族自治區均只有8個亞屬，梁鋮等[16]在對云南熊蜂資源的調查中共發現8個亞屬，王哲哲[25]在對貴州熊蜂資源的研究中也只發現8個亞屬。與青藏高原其它地區相比，三江源地區的熊蜂組成情況存在較大不同。在王磊等[2]對青海省東部地區熊蜂多樣性的調查中發現，黑尾熊蜂、紅束熊蜂、克什米爾熊蜂和亞洲熊蜂均為優勢種(相對豐度Ra≥10%)，穩紋熊蜂為豐盛種(5%≤Ra<10%)；而三江源地區的優勢種為克什米爾熊蜂和穩紋熊蜂，紅束熊蜂、黑尾熊蜂和亞洲熊蜂分別為豐盛種、常見種(1%≤Ra<5%)和稀有種(Ra<0.1%)；在青海省東部地區相對豐度不足1%的越熊蜂和拉達克熊蜂是三江源地區的豐盛種。這種差異的出現可能與三江源地區的高海拔環境有關，高海拔環境可能更適合克什米爾熊蜂和穩紋熊蜂等高原特有種，較不利于其他種棲息。本研究發現，一些熊蜂在三江源地區具有較高的相對豐度，但其分布范圍卻較小，一些地理距離較近的地區卻具備較低的物種相似性。這種空間組成差異應與環境差異有關。Williams等[17]發現，光照和降水等氣候因素與青藏高原不同地區熊蜂組成差異有關；但氣候、地理和土壤等因素對熊蜂空間組成差異的相對重要性有待被揭示。

4 結論

本研究通過野外樣品采集、形態學鑒定和分子生物學鑒定，系統地調查并分析了三江源地區熊蜂組成情況。共有隸屬于9個亞屬的21種熊蜂被發現，其中包括一未知種B.sp. SJY-2019。三江源地區物種多樣性水平略低于周邊地區，但高于其他高寒地區；該地區與周邊地區的熊蜂組成差異大，而空間組成差異在三江源地區內的不同區域間也比較明顯。