花棒種子萌發對NaCl及聚乙二醇脅迫的響應

鄒 瑾， 王曉佳， 曹 兵*， 李運毛， 馮學瑞， 劉佳欣

(1. 寧夏大學農學院， 寧夏 銀川 750021； 2. 寧夏銀川市中山公園， 寧夏 銀川 750001)

我國西北地區為大陸性氣候區，降水稀少，植被分布稀疏，土壤蒸發量較大，鹽分在地表聚集，導致鹽漬化問題顯著[1]，荒漠化問題長期存在，生態環境修復問題受到廣泛關注。許多學者對西北地區的荒漠化治理、植被恢復以及對鹽漬化土地的開發利用等問題進行了研究，認為改善本地區生態環境最有效、最經濟的生物措施是栽種耐鹽、耐旱植物[2-4]。花棒(HedysarumscopariumFisch. et Mey.)為豆科巖黃耆屬半灌木，其生長迅速，根系發達，樹形獨特，具有抗旱、耐風蝕、適應性強的特點，是優良的固沙灌木樹種[5]。花棒不僅可以營造獨特的沙漠景觀，其根際和非根際中的根瘤菌與其本身共生形成根瘤，實現共生固氮，對當地生態平衡的維持、土壤改良等有著重要貢獻。此外，其枝干中富含油脂，可以作為生物燃料的補充，嫩枝葉可成為牛羊飼料，種子可以榨油[6]，花期較長，花色艷麗，不僅可以用來作為潛在能源植物[7]，也是優質的蜜源植物[8]。由此可見，花棒的生態和經濟價值都十分顯著[9]。生產中主要通過植苗和直播造林方式應用，花棒種植方式簡單、成本較低，被廣泛用于沙區生態環境的修復治理。

對于干旱荒漠區植物種子而言，鹽分和濕度是測定其抗逆性的重要影響因素[10-12]，研究植物抗逆性的關鍵時期是種子萌發時期。在植物所遭受的各種非生物災害中，干旱對其生長造成的危害最為嚴重[13]；鹽適應性是鹽生環境下植物生存的首要條件，亦是干旱區植物長期進化過程中需適應的重要因子[14]。采用NaCl和PEG-6000處理種子，分別模擬鹽、旱脅迫環境，探究植物種子萌發期的抗逆性[15]，這種試驗方法已在檸條[16-17]、刺鈴鐺[18]、沙蒿[19]等植物的抗鹽旱研究中成功應用，但不同植物其種子萌發期、苗期、幼年期等不同生長發育階段對土壤水分和鹽分有不同的適應性[20]。花棒根系發達、葉片小，抗旱性強，是干旱沙區植被恢復與重建的優選樹種之一。目前對花棒的研究主要集中在沙埋深度影響[21]、環境因子影響[22]及其生理生態[5]等方面，未見有關其種子萌發期抗旱、耐鹽的研究報道。本試驗采用不同濃度的NaCl溶液和PEG-6000溶液，分別模擬不同程度鹽脅迫和干旱脅迫環境，測定花棒種子萌發指標，分析花棒種子萌發期對鹽、旱脅迫的反應，以期為花棒的人工培育及直播造林提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花棒種子于2021年在寧夏上谷農牧種子公司購買。試驗所用鹽(NaCl)、聚乙二醇6000(PEG-6000)分析純試劑，均為天津市大茂化學試劑廠生產。

1.2 試驗方法

1.2.1種子預處理 試驗前挑選種粒飽滿、大小相同、無病蟲害的花棒種子，去除果莢[22]，用0.3%的高錳酸鉀溶液浸泡消毒(10 min)后，用蒸餾水進行反復沖洗，濾紙吸干表面水分備用。

1.2.2試驗設計 試驗采用紙上發芽法，配置不同濃度的NaCl溶液和PEG-6000溶液，分別模擬不同程度鹽脅迫和干旱脅迫環境下花棒種子的萌發狀況。按照Michel[23]、陳東凱[19]等的方法，結合預試驗結果，本試驗確定設置5個不同濃度(質量分數)NaCl溶液，分別為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%模擬鹽脅迫[24-25]；設置5個不同濃度(質量分數)PEG-6000溶液，分別為5%，10%，15%，20%，25%模擬干旱脅迫[26-27]，PEG-6000濃度對應水勢為-0.10，-0.20，-0.40，-0.60，-0.86 MPa[28]。試驗共設置12組處理，其中蒸餾水對照(CK1，CK2)2組，NaCl溶液5組，PEG-6000溶液5組；每組處理3個重復，共計36個培養皿，每培養皿放置30粒種子，培養皿標記處理編號。先將培養皿(內徑90 mm)用高壓滅菌鍋進行消毒30 min，取出放入雙層大小與培養皿內徑一致的干凈無菌濾紙。用移液槍往對應編號的培養皿中分別加入不同濃度的NaCl溶液及無菌蒸餾水(CK1)、不同濃度的PEG溶液及無菌蒸餾水(CK2)，至濾紙飽和并依次稱重記錄。將所有處理的培養皿放入人工氣候箱中培養，溫度為25℃、濕度60%、光照晝夜時間為12 h/12 h。每天定量加入各溶液，補充散失水分，同時稱重并做好記錄，每2 d更換濾紙，維持正常環境水勢[29]。

1.3 指標測定及方法

本試驗從種子置床之日起每隔24 h觀察1次，種子露白即可認定為萌發；在3次重復中，有1粒以上的種子出現萌發，可認定是種子萌發開始期，每天在規定的時間內觀察種子萌芽情況并做好記錄[18]，參照《國際種子檢驗規程》，以連續3 d無種子發芽作為發芽試驗的結束。完成試驗后，做好各指標計算工作，選擇胚根完整的10株幼苗，用精度為0.02 mm的數顯游標卡尺測量其胚根長并取平均值。正常萌發閾值的確定參照《GB7908-1999林木種子質量分級》[30]，以花棒一級種子發芽率為標準，發芽率高于70%而低于對照組，則認定為該濃度對種子萌發有影響；發芽率低于70%，則被認定該濃度抑制了種子萌發，其他萌發指標參照發芽率抑制濃度，以對照組的50%為標準判定。

逐日萌發率(Daily germination rate，DGR)=t/N×100%，t為萌發期內每天正常發芽種子數量。

發芽率(Germination rate，GR)=n/N×100%，n代表正常發芽種子數量，N為種子總數。

發芽勢(Germination potential，GP)=m/N×100%，m為總萌芽天數前1/3 d種子發芽數量。

發芽指數(Germination index，GI)=∑(Gt/Dt)，Gt為在t天發芽種子數量，Dt為對應發芽天數。

活力指數(Vigor index，VI)=GI×Sx，Sx為種子胚根長度。

1.4 數據處理

使用Microsoft excel 2010對數據進行整理，用SPSS 26.0軟件進行統計分析(多重比較選擇Duncan方法，其中置信水平具體為95%)，用Origin 2018軟件來進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對花棒種子萌發的影響

2.1.1鹽脅迫對花棒種子逐日萌發率的影響 在不同NaCl濃度處理下，花棒種子起始萌發天數分別為第1，1，1，4，5，5 d(圖1)。隨NaCl濃度不斷升高，花棒種子起始萌發時間延后，不同濃度NaCl對花棒萌發存在不同程度抑制作用：種子逐日萌發率峰值均明顯低于CK1，當鹽脅迫逐步增強時，種子逐日萌發率峰值出現時間明顯滯后，種子停止萌發天數對應分別為第6，11，14，14，12，14 d。

圖1 不同濃度NaCl脅迫對花棒種子逐日萌發率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NaCl stress on daily germination rate of Hedysarum scoparium seeds

2.1.2鹽脅迫對花棒種子發芽率及發芽勢的影響 不同濃度NaCl溶液處理，花棒種子發芽率、發芽勢差異性顯著(圖2)。隨著NaCl濃度逐漸升高，花棒種子的發芽率整體呈下降趨勢，且與對照組表現出顯著差異(P<0.05)。當使用0.2%濃度的NaCl溶液處理種子時，花棒種子發芽率為83.3%，高于70%，為對照組的87.1%；當NaCl溶液濃度為0.4%時，種子發芽率為46.7%，為對照組的47.1%，出現明顯抑制作用；當溶液濃度達到1.0%時，種子的發芽率低至8.9%，僅為對照組的9.3%。說明當NaCl濃度逐步升高時花棒種子的發芽率呈線性降低，當NaCl濃度為0.2%時，花棒種子發芽率受到一定影響，當NaCl溶液濃度達到0.4%時，花棒種子發芽率明顯降低，該濃度明顯抑制種子發芽。

圖2 不同濃度NaCl脅迫對花棒種子發芽率與發芽勢的影響Fig.2 Effects of different concentrations of NaCl stress on germination rate and germination potential of Hedysarum scoparium seeds注：不同小寫字母表示同一溶液不同濃度處理下差異顯著(P<0.05)，下同Note:Differen lowercase letters indicate the significant difference under different concentrations of the same solution at the 0.05 level,the same as below

發芽勢是指在種子萌發試驗中，從開始發芽到最高峰時，已經發芽的種子數占測試種子總粒的比重[31]。當NaCl溶液濃度逐步升高時，花棒種子發芽勢整體呈下降趨勢。用0.2%濃度NaCl溶液處理花棒種子時，其發芽勢為50%，為對照組的52.3%；當NaCl溶液濃度達到0.4%時，其發芽勢為1.1%，僅為對照的10.4%，出現明顯抑制作用；隨著濃度增高，花棒種子發芽勢急劇降低，與對照存在顯著差異(P<0.05)。

2.1.3鹽脅迫對花棒種子發芽指數及活力指數的影響 發芽指數是指測試種子發芽成活指數情況，用來表示該測試種子實際均值發芽率[32]。花棒種子在不同濃度NaCl溶液處理后，其發芽指數和活力指數總體皆呈下降趨勢，且差異顯著(圖3)。當使用0.2%濃度的NaCl溶液處理花棒種子時，種子發芽指數為36.1，為對照組的54.8%；當NaCl濃度達到0.4%時，其發芽指數為10.9，為對照的16.5%，產生明顯抑制作用(P<0.05)；當NaCl濃度達到1.0%時，其發芽指數僅為1.3，為對照的2.0%。可見，隨著處理濃度的升高，花棒種子發芽指數下降幅度明顯增加，受抑制作用明顯。

圖3 不同濃度NaCl脅迫對花棒種子發芽指數與活力指數的影響Fig.3 Effects of different concentrations of NaCl stress on germination index and vigor index of Hedysarum scoparium seeds

活力指數用來表示種子迅速整齊萌發潛勢和生長力情況[33]。在NaCl溶液的不同濃度處理下，花棒種子的活力指數整體呈下降趨勢。當使用0.2%濃度的NaCl溶液處理花棒種子時，種子活力指數為4.0，為對照組的42.6%，開始產生抑制作用；當使用NaCl濃度達到0.4%時，其活力指數為0.7，僅為對照組的7.4%，產生明顯抑制作用(P<0.05)。可見，相對于其他萌發指標，活力指數對NaCl脅迫響應較為敏感。

2.2 干旱脅迫對花棒種子萌發的影響

2.2.1干旱脅迫對花棒種子逐日萌發率的影響 干旱脅迫下花棒種子起始萌發天數分別為第1，1，1，1，1，3 d(圖4)。當PEG-6000溶液達到25%的濃度時，花棒種子起始萌發的時間延后，抑制了萌發進程。當PEG-6000溶液為5%，10%，15%時，花棒種子逐日萌發率的峰值分別為36%，24%，17%，均小于對照組CK2，但與對照組的逐日萌發率峰值同天出現。當PEG-6000溶液濃度≥20%時，種子逐日萌發率的峰值出現明顯滯后現象。

圖4 不同濃度PEG-6000脅迫對花棒種子逐日萌發率的影響Fig.4 Effects of different concentrations of PEG-6000 stress on daily germination rate of Hedysarum scoparium seeds

2.2.2干旱脅迫對花棒種子發芽率及發芽勢的影響 隨著PEG-6000溶液濃度逐步升高，花棒種子發芽率及發芽勢呈下降趨勢(圖5)。當PEG-6000溶液為15%時，花棒種子的發芽率達到87.7%，為對照的91.6%，此時與對照組差異不顯著；當溶液濃度達到20%時，種子發芽率開始降低為67.7%，與對照組差異顯著(P<0.05)；當PEG-6000溶液為25%時，花棒種子發芽率降低至25.7%，僅為對照組的26.9%。可見，當PEG-6000溶液濃度高于20%時，發芽率低于70%，該環境對花棒種子發芽率存在顯著抑制作用。

圖5 不同濃度PEG-6000脅迫對花棒種子發芽率和發芽勢的影響Fig.5 Effects of different concentrations of PEG-6000 stress on germination rate and germination potential of Hedysarum scoparium seeds

對于發芽勢來說，當PEG-6000溶液濃度為5%時，種子發芽勢為86.7%，為對照組的90.7%，與對照組無顯著差異；當溶液濃度達到10%時，種子發芽勢為77.0%，為對照組的80.5%，與對照組產生顯著差異(P<0.05)，但與5%濃度處理發芽勢差異不顯著；當溶液濃度逐步增加到15%時，其種子發芽勢為52.2%，為對照組的54.6%；當濃度增加至20%時，花棒種子發芽勢為31.1%，僅為對照組的32.5%，產生明顯抑制作用；當溶液濃度達到25%時，花棒種子發芽勢降低至5.6%。因此，隨著PEG-6000溶液濃度的升高，花棒種子的發芽率及發芽勢均呈下降趨勢，當PEG-6000溶液濃度高于15%時，對花棒種子的發芽率及發芽勢產生明顯抑制作用。

2.2.3干旱脅迫對花棒種子發芽指數及活力指數的影響 隨著PEG-6000溶液濃度的升高，花棒種子的發芽指數與活力指數均呈下降趨勢(圖6)。當PEG-6000溶液濃度為5%時，花棒種子發芽指數為62.3，與對照組無顯著差異；當PEG-6000溶液濃度為10%時，其發芽指數為53.6，為對照組的83.4%，雖未產生抑制作用，但表現出顯著差異(P<0.05)；當PEG-6000溶液濃度為15%時，種子發芽指數為35.6，為對照組的55.4%，沒有產生明顯抑制作用；當溶液濃度為20%時，種子發芽指數為22.0，為對照組的34.2%，此時產生明顯抑制作用；在溶液濃度達到25%時，種子發芽指數僅為5.0。

圖6 不同濃度PEG-6000溶液脅迫對花棒種子發芽指數與活力指數的影響Fig.6 Effects of different concentrations of PEG-6000 stress on germination index and vigor index of Hedysarum scoparium seeds

隨著PEG-6000溶液濃度不斷升高，花棒種子活力指數下降幅度不斷增大，表現出顯著差異(P<0.05)。當溶液濃度為5%時，其活力指數為7.4，為對照的79.6%；當PEG-6000溶液濃度為15%時，花棒種子活力指數為3.8，為對照組的40.4%，開始產生抑制作用；當溶液濃度升高至20%時，其活力指數為1.3，為對照組的14%，抑制作用明顯；當溶液濃度達到25%時，其活力指數僅為0.1，為對照組的1.0%。由此可得出，隨著PEG-6000溶液濃度升高，種子活力指數下降，當PEG-6000溶液濃度大于15%時，活力指數下降趨勢明顯，種子生長潛力明顯降低，可見花棒種子活力指數對PEG-6000脅迫響應較為明顯。

3 討論

3.1 花棒種子萌發對NaCl脅迫的響應

本試驗通過運用不同濃度NaCl溶液模擬不同程度鹽脅迫環境，觀察記錄花棒種子在鹽脅迫環境下萌發情況，探討花棒種子的耐鹽性。關于NaCl溶液對種子萌發的影響，目前有兩種結果，喬楓、朱金方等在沙棘[34]和檉柳[35]種子上得出的研究結果顯示，低濃度NaCl脅迫有助于種子萌發[3]，高濃度時則存在抑制作用。張建鋒等[36]在研究流蘇和香椿種子時得出結果顯示，各濃度NaCl脅迫均會抑制種子萌發，且濃度越大，引發的抑制作用會越明顯。本試驗得出的結果與張建鋒等研究結果相似。當NaCl濃度為0.2%時，花棒種子內部膜系統可以有效修復[37]，該濃度發芽率為83.3%，未產生抑制作用；隨著NaCl濃度增加，種子內部膜系統的修復逐漸延緩，當濃度達到0.4%時，種子內部膜系統不能修復，發芽率僅為46.7%，受抑制作用較為明顯。在本試驗中，低于0.2% NaCl濃度并未抑制種子的萌發，當濃度不斷升高時，花棒種子各項萌發指標急劇下降。由此可推知，在含鹽量較低的環境下，花棒種子具有一定的耐受性，該研究結果和楊佳鑫[38]、朱金方等[35]研究觀點相似，后期應開展系統選育，以培育耐鹽品種，探究利用沙區地下鹽水進行固沙造林的方法。

3.2 花棒種子萌發對模擬干旱脅迫的響應

PEG-6000是常見的大分子滲透調節劑，通過對種子滲透壓進行調整，改變水勢環境，對水分進入種子內進行限制[39]，使種子內的各種細胞、酶處于活化狀態。因此，采取PEG-6000溶液處理花棒種子，模擬干旱對種子的脅迫試驗，實際上是利用其對種子所具有的這種滲透調節作用[40]。通過本試驗發現，當PEG-6000溶液≤5%時，花棒種子萌發能力受到影響并不顯著，當溶液濃度高于15%時，花棒種子各萌發指標均與對照存在顯著差異。可見，當PEG-6000濃度≤15%時，花棒種子的發芽能力未受到明顯影響；而當溶液濃度達到20%時，各項發芽指標明顯受抑制作用；當PEG-6000溶液濃度為25%時，對應環境水勢具體為-0.86 MPa[41]，在這種環境下花棒種子的發芽率為25.6%，說明在重度干旱脅迫環境下，花棒種子也具有一定的耐受性。有研究表明，輕微干旱脅迫環境能促使種子啟動自我保護機制，緩解種子吸脹過程中對膜系統造成的損傷，這對修復膜系統極為有益，進而有助于植物種子發芽率的提升[42-43]。姜生秀、劉帥等對沙冬青[44]、沙棘[34]、檉柳[45]等沙生植物抗旱性研究結果與上述結果一致。本試驗得出的結果與上述結果不同，花棒種子的發芽率受種子采摘年份影響較大，低濃度PEG-6000環境對花棒種子發芽率的提升不明顯，所以輕微干旱是否能促使種子萌發，可能還與受到脅迫種子的種類、采摘年份及其生長環境等因素有關。

通過本試驗可知，花棒種子萌發能力隨NaCl和PEG-6000溶液濃度的升高均呈下降趨勢，揭示了花棒種子萌發的NaCl和PEG-6000濃度界限，對其選擇適宜栽植的環境條件和區域提供參考價值。本試驗初步得到了花棒種子在鹽旱條件下的萌發閾值，但是花棒種子在萌發過程中，其生理指標受鹽旱脅迫下出現的具體特征、相應變化以及構建耐鹽基因載體，改良植株培育等問題，還需要進行深入研究。

4 結論

本試驗結果表明，隨著NaCl濃度的升高花棒的萌發能力呈下降趨勢，當NaCl濃度高于0.2%時，種子各項萌發指數均急劇下降，說明花棒耐鹽性相對較低。隨著PEG-6000溶液濃度的升高花棒種子萌發能力同樣呈下降趨勢，當PEG-6000溶液濃度高于15%時，種子各萌發指標顯著降低，種子萌發受抑制作用明顯。因此，花棒種子萌發能忍耐的模擬鹽脅迫和干旱脅迫的濃度分別為0.2% NaCl，15% PEG-6000，花棒種子萌發期能忍耐低鹽分、中度干旱脅迫。