lncRNA GK-IT1通過調控醛縮酶A影響非小細胞肺癌細胞的惡性進展

劉子楊，王小文，陳 力

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸心外科，重慶 400016

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬新增患者［1］。在我國，2020年肺癌新發(fā)病例數和死亡病例數居各類腫瘤之首［2］。肺癌可分為 非 小 細 胞 肺 癌 （non-small-cell lung cancer，NSCLC）與小細胞肺癌。據估計，NSCLC 約占所有肺癌的80%，是最常見的具有高侵襲性的肺癌類型之一。盡管診斷及治療方式在不斷發(fā)展，NSCLC患者5年生存率仍然低于20%，死亡的主要原因是發(fā)生遠處轉移［3］，而在此過程中腫瘤細胞的侵襲與遷移可能發(fā)揮著重要作用。目前，對于NSCLC 侵襲與遷移的機制尚不完全清楚。因此，尋找新的影響NSCLC 侵襲與遷移的潛在靶點，對提高NSCLC 治療效果及改善患者臨床預后有著積極意義。

眾所周知，絕大多數癌細胞的能量產生形式為糖酵解，其中糖酵解酶起著關鍵作用。而糖酵解酶屬于兼職酶，不僅具有催化功能，還可發(fā)揮類似RNA 結合蛋白的作用。醛縮酶是糖酵解過程的參與者之一，其中醛縮酶A（aldolase A，ALDOA）是幾乎所有癌癥中含量最豐富的醛縮酶異構體［4］，其在多種類型的癌癥（包括肺癌、肝細胞癌、結腸直腸癌和胰腺癌）中高表達［5］。ALDOA 可以與長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）共同調節(jié)癌細胞的生物學功能，比如ALDOA可以與lncRNADIO3OS共同調節(jié)胰腺癌細胞的增殖和侵襲能力［6］。研究表明，lncRNAArst可通過調控ALDOA介導的肌動蛋白骨架完整性來抑制膠質瘤進展［7］。目前，關于lncRNA 與ALDOA 之間關系的研究還相對較少。因此，探索lncRNA 是否通過ALDOA 影響NSCLC 的生物學功能可能是一個潛在的研究方向。

lncRNA 已被證實與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程息息相關［8］。lncRNA 廣泛參與不同水平的基因調控，比如表觀遺傳調控、轉錄和轉錄后加工等［9］，也可作為腫瘤抑制因子或癌基因而發(fā)揮作用［10］。值得注意的是，lncRNA 的獨特特征也可能反映癌癥的進展，影響腫瘤中的多種生物學過程［11-13］。在之前的研究［14］中，我們發(fā)現甘油激酶-內含子轉錄本1（glycerol kinase-intronic transcript 1，GK-IT1）在食管鱗癌細胞中高表達，且能調控其增殖與凋亡，但GK-IT1在NSCLC 及其他腫瘤疾病中發(fā)揮的作用尚不明確。因此，本研究旨在探索lncRNAGK-IT1與ALDOA 對NSCLC 細胞惡性表型的影響，以期為進一步研究NSCLC的疾病發(fā)展與靶向治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與臨床組織標本 人NSCLC 細胞株A549、H358 均購自武漢普諾賽公司。正常支氣管上皮細胞BEAS-2B，人NSCLC 細胞株H1299、H1975受贈于重慶醫(yī)科大學實驗研究中心。

42 對癌及癌旁組織均來自2020 年12 月-2021 年7月在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院首次確診的NSCLC患者。其中男性17 例，女性25 例，年齡40～82 歲。按照第8 版肺癌TNM 分期系統(tǒng)進行T 分期統(tǒng)計，其中T1/T2期24例，T3/T4期18例。所有組織標本由重慶醫(yī)科大學實驗研究中心保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM F-12K 培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco 公司，BeyoClick EdU-555 細胞增殖檢測試劑盒和Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TRIzol 裂解液、SYBR Premix EX Taq Ⅱ試劑盒、PrimeScript 反轉錄試劑盒購自大連TaKaRa 公 司；GK-IT1的 小 干 擾RNA （small interfering RNA， SiRNA）、 陰 性 對 照（SiRNA negative control，Si-NC）及轉染試劑均購自重慶萊伯斯生物技術有限公司；熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，FISH）實驗試劑盒及混合探針購自廣州銳博生物有限公司；GK-IT1、ALDOA及甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的特異性引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；PAGE 凝膠（10%）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，抗波形蛋白（vimentin） 抗 體（R22775）、抗E 鈣 黏 蛋 白（Ecadherin） 抗 體（R22490）、抗N 鈣 黏 蛋 白（Ncadherin）抗體（R23341）、抗肌動蛋白（β-actin）抗體（380624） 購自成都正能生物有限公司，抗ALDOA抗體（ab150396）購自英國Abcam公司。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀（CFX96）購自美國Bio-rad 公司，多功能酶標儀購自美國Thermo Electron 公司，顯微鏡和配套成像系統(tǒng)購自日本Olymous公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 NSCLC 細胞A549 使用DMEM F-12K培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素），H358使用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素），于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期的細胞，以4×105個/孔的密度接種至6 孔板內，待細胞生長至匯合度為70%時，按照轉染試劑說明書，向細胞中分別轉入Si-GK-IT1#1、Si-GK-IT1#2、Si-NC 或ALDOA 過表達質粒（購自上海漢恒生物科技有限公司），待24、48 h 后進行后續(xù)實驗。SiRNA 序列信息如下：Si-GK-IT1#1 正義鏈為5′-CGU UGA GAG UCU UAG UAAA-3′，反義鏈為5′-UUU ACU AAG ACU CUC AACG -3′；Si-GK-IT1#2 正 義 鏈 為5′-GGA AGG UUC UGU AGC UAUA-3′，反義鏈為5′-UAU AGC UAC AGA ACC UUCC-3′；Si-NC 正義鏈為5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACGU-3′，反義鏈為5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGAA-3′。

1.2.2 qRT-PCR 檢測NSCLC 組織及細胞株中的GKIT1表達水平 在50 mg 凍存的NSCLC 組織和癌旁組織中，分別加入1 mL TRIzol；在人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B及轉染了SiRNA的A549、H358細胞中加入1 mL TRIzol。提取的總RNA 用酶標儀檢測其純度與濃度。取1 μg RNA反轉錄為cDNA。qRT-PCR檢測NSCLC組織及癌旁組織的GK-IT1及ALDOA相對表達水平，再以相同的方法檢測上述細胞株中的GK-IT1的表達水平。qRT-PCR 的10 μL 擴增體系：5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、1 μL cDNA、上下游引物各0.5 μL、3 μL DEPC 水。程 序 設 置 為：95 ℃3 min；95 ℃5 s，60 ℃25 s，72 ℃25 s，循環(huán)數為40次。每個 樣 本 設 置3 個 復 孔，采 用2-ΔΔCT法 對GK-IT1、ALDOA表達水平進行分析。所設計的GK-IT1引物上游序列為5′-AGC GGT AGA GTC AGC TCT GTT TG-3′，下游序列為5′-CAC CAT GCC CAG CCG TAAC-3′。ALDOA特異性引物的上游序列為5′-GGA AAA GGG CAG GGG TCA TTA-3′，下游序列為5′-AGT AGC AAG TTC CTG CGGC-3′。GAPDH引物上游序列為5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3′，下游序列為5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′。

1.2.3 CCK-8 實驗 實驗分為Si-NC、Si-GK-IT1#1、Si-GK-IT1#2共3組。將各實驗組細胞按3 000個/孔接種于96孔板，每組3個復孔。待細胞貼壁之后，取出一塊96 孔板，避光，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，繼續(xù)避光孵育90 min。隨后以酶標儀檢測波長為450 nm 處的吸光度值［D（450 nm）］，共檢測4 d，繪制細胞生長曲線。共轉染Si-GK-IT1#2與ALDOA過表達質粒后，進行CCK-8 挽救實驗，分為對照（control， Ctrl）、 Si-GK-IT1#2 及Si-GK-IT1#2+ALDOA組，操作同前。

1.2.4 EdU 實驗 實驗分為Si-NC、Si-GK-IT1#1、Si-GK-IT1#2 共3 組。將各組細胞以2×105個/孔接種于鋪有爬片的24 孔板，待細胞匯合度為70%～80%時，按照EdU 試劑盒說明書進行后續(xù)實驗。待上述步驟完成后，小心取出爬片，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡拍照。記錄視野內EdU陽性細胞與細胞總數之比。共轉染Si-GK-IT1#2 與ALDOA過表達質粒后，行EdU 挽救實驗，分為Ctrl、Si-GK-IT1#2、Si-GKIT1#2+ALDOA組，操作同前。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 基質膠制備：各取97 μL培養(yǎng)基，分別加入3 μL Matrigel，充分混勻，每個小室加入100 μL 混勻后的液體，放置于37 ℃環(huán)境中1 h，使Matrigel凝聚成膠。實驗分為Si-NC、Si-GK-IT1#1、Si-GK-IT1#2共3組。使用不含血清的培養(yǎng)基將各組細胞按2×105個/孔加入上室內，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。隨后取出小室，4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色，棉簽輕柔擦掉上層殘留細胞，待自然晾干后拍照。隨機取3個視野，統(tǒng)計視野內可見細胞個數。共轉染Si-GK-IT1#2 與ALDOA過表達質粒后，行Transwell 侵襲實驗，分為Ctrl、Si-GK-IT1#2、Si-GK-IT1#2+ALDOA組，操作同前。

1.2.6 細胞劃痕實驗 實驗分為Si-NC、Si-GK-IT1#1、Si-GK-IT1#2 組。在6 孔板背面垂直于長軸用直尺標記劃豎線，再將各實驗組細胞按6×105個/孔接種于6孔板，緩慢輕柔混勻。待細胞鋪滿小孔后，用槍頭順著豎線筆直劃痕，PBS 清洗掉落的細胞。第0、24 h取樣，測量并記錄細胞遷移的距離，計算遷移率。共轉染Si-GK-IT1#2 與ALDOA過表達質粒后，行細胞劃痕實驗，分為Ctrl、Si-GK-IT1#2、Si-GK-IT1#2+ALDOA組，操作同前。

1.2.7 FISH 實驗 按照說明書利用所合成的混合探針在H358 和A549 細胞上進行FISH 實驗。用1×PBS預洗細胞5 min。將2.5 μL 探針加入100 μL 含10%甲酰胺、2×檸檬酸鹽鈉、10%硫酸葡聚糖的預雜交液中進行雜交。在37 ℃的濕化室中雜交過夜。雜交結束后，PBS清洗2次，每次5 min，成像并記錄。細胞紅色熒光范圍表示GK-IT1的亞細胞定位。

1.2.8 RNA 免疫共沉淀實驗 A549 或H358 細胞在1 mL 裂解緩沖液中裂解，吹打混勻，置于冰上10 min。4 ℃、14 000×g離心10 min 后取上清。加入蛋白 A/G 磁 珠 進 行 RNA 免 疫 共 沉 淀 （RNA immunoprecipitation，RIP）實驗。分別將裂解產物與5 μL 兔抗ALDOA、正常兔抗IgG 在4 ℃條件下孵育過夜，4 ℃、12 000×g離心10 min，保留沉淀，加入1 μL洗脫緩沖液，清洗3次，每次2 min。使用Trizol裂解液提取RNA，進行qRT-PCR 檢測，操作步驟與檢測條件同前。設置抗IgG 組與抗ALDOA 組。采用2-ΔΔCT法對GK-IT1表達水平進行統(tǒng)計，以此確定相對抗IgG 組，結合于抗ALDOA 組的RNA 中GK-IT1是否呈明顯富集。

1.2.9 生物信息學分析 通過RNA-蛋白質相互作用預 測 網 站 RPIseq （http：//pridb. gdcb. iastate. edu/RPIseq/）分析GK-IT1與ALDOA 蛋白的相互作用關系，結果以RF classifier（Range Forest classifier）和SVM classifier （Support Vector Machine classifier） 2種算法呈現。計算RNA 與蛋白質的相互作用概率。相互作用概率大于0.5，表明相應的RNA 與蛋白質相互作用概率較大。

1.2.10 Western blotting實驗 將各組細胞收集待用，加入RIPA 細胞裂解液于4 ℃反應30 min，超聲裂解，4 ℃、12 000×g離心15 min之后提取蛋白。按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。按照說明書配置PAGE凝膠（10%），每個電泳槽加入20 μg蛋白樣本，進行電泳分離，在冰浴條件下將蛋白轉移至PVDF 膜，將PVDF 膜放至脫脂奶粉中，然后于常溫搖床上封閉1 h。分別加入上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關蛋白抗體（抗vimentin 抗體、抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體）、抗β-actin抗體和抗ALDOA 抗體，于4 ℃搖床上過夜。室溫搖床上孵育正常兔抗IgG 1 h。TBST 洗膜3 次，每次5 min，顯影分析電泳條帶。

1.3 統(tǒng)計學分析

分別采用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 8.0 軟件進行數據分析和繪圖。定量資料用±s表示。采用獨立樣本t檢驗分析2 組數據間的差異；多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），若差異有統(tǒng)計學意義則用最小顯著性差異法進行2 組間比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組織中GK-IT1與ALDOA高表達

42 對癌及癌旁組織的qRT-PCR 分析結果顯示，NSCLC 組織中GK-IT1與ALDOA的表達量均高于癌旁組織（圖1A、B，均P<0.05）。將42 例病例按T 分期分為T1/T2組（n=24）和T3/T4組（n=18），分析2組GK-IT1表達量的差異。結果顯示，T3/T4組中GK-IT1的表達水平明顯高于T1/T2組（圖1C，P=0.009）。

圖1 NSCLC組織中GK-IT1及ALDOA的表達Fig 1 Expression of GK-IT1 and ALDOA in NSCLC tissues

2.2 GK-IT1在NSCLC細胞株中的表達水平及敲低效率

為了篩選出實驗所用的細胞系，用qRT-PCR 檢測人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B 以及NSCLC 細胞株（H358、A549、H1975、H1299）中GK-IT1的相對表達水平。與正常支氣管上皮細胞BEAS-2B 相比，A549 及H358 細胞中GK-IT1的表達量明顯升高，而H1299 和H1975 細胞中GK-IT1表達量無明顯變化（圖2A，均P>0.05），故采用A549 及H358 細胞進行后續(xù)實驗。為了避免脫靶效應，將設計好的2 條SiRNA 序列（Si-GK-IT1#1 及Si-GK-IT1#2）轉染至A549 及H358 細胞內，采用qRT-PCR 檢測GK-IT1的表達量。結果顯示，與Si-NC 組相比，H358 細胞中2條SiRNA 序列的敲低效率分別為48%和53%，A549細胞中Si-GK-IT1#1 和Si-GK-IT1#2 的敲低效率分別為37%和50%（圖2B、C，均P<0.05）。

圖2 GK-IT1在NSCLC細胞系中的表達及其敲減效果Fig 2 GK-IT1 expression and knockdown effect in NSCLC cell lines

2.3 敲減GK-IT1 對A549 及H358 細胞增殖能力的影響

完成SiRNA 轉染之后，利用CCK-8 實驗檢測NSCLC 細胞的增殖能力。結果表明，敲減GK-IT1明顯降低了H358 及A549 細胞的增殖能力（圖3A、B，均P<0.05）。EdU 實驗結果顯示，Si-GK-IT1#1 及Si-GK-IT1#2組細胞的EdU 陽性比例明顯低于Si-NC 組，表明GK-IT1敲減的NSCLC 細胞增殖能力降低（圖3C，均P<0.05）。

圖3 敲減GK-IT1對NSCLC細胞增殖的影響Fig 3 Effects of GK-IT1 knockdown on the proliferation of NSCLC cells

2.5 敲減GK-IT1 對A549 及H358 細胞侵襲和遷移能力的影響

分別敲低A549、H358 細胞中的GK-IT1后，采用Transwell侵襲實驗進行檢測。結果顯示，與Si-NC組相比，Si-GK-IT1#1 及Si-GK-IT1#2 組穿膜細胞個數明顯減少，侵襲能力明顯減弱（圖4A～C，均P=0.000）。并且在細胞劃痕實驗中，發(fā)現Si-GK-IT1#1及Si-GK-IT1#2 組細胞的24 h 遷移率較Si-NC 組明顯降低（圖4D～F，均P=0.000）。

圖4 敲減GK-IT1對NSCLC細胞侵襲及遷移能力的影響Fig 4 Effects of GK-IT1 knockdown on the invasion and migration of NSCLC cells

2.6 GK-IT1亞細胞定位的檢測

為了探究GK-IT1影響細胞功能的作用機制，采用FISH 實驗對A549 及H358 細胞中的GK-IT1進行亞細胞定位檢測。紅色熒光的范圍可反映GK-IT1的細胞內分布情況。從圖5可知，GK-IT1存在于細胞核和細胞質，但其主要分布于細胞質中。

圖5 GK-IT1的亞細胞定位Fig 5 Subcellular localization of GK-IT1

2.7 敲減GK-IT1 對A549 及H358 細胞中ALDOA及EMT相關蛋白表達的影響

敲低GK-IT1后，通過Western blotting 檢測A549、H358細胞中vimentin、E-cadherin、N-cadherin及ALDOA蛋白的表達（圖6）。與Si-NC組相比，Si-GK-IT1#1及Si-GK-IT1#2組A549、H358細胞中vimentin、ALDOA蛋白表達水平下降，而E-cadherin蛋白表達水平升高（均P<0.05），N-cadherin蛋白表達水平變化無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。提示GK-IT1可能通過調節(jié)ALDOA 及EMT相關蛋白的表達來影響NSCLC的EMT過程。

圖6 敲減GK-IT1對NSCLC細胞中ALDOA及EMT相關蛋白表達水平的影響Fig 6 Effects of GK-IT1 knockdown on the expression of ALDOA and EMT-related proteins in NSCLC cells

2.8 GK-IT1與ALDOA蛋白的相互作用

進一步通過生物信息學分析探索A549、H358細胞中GK-IT1與ALDOA 之間的潛在關系，結果顯示，RF classifier 和SVM classifier 結果分別為0.65 和0.87（圖7A），說明GK-IT1與ALDOA 蛋白的相互作用概率較大。RIP 實驗結果表明，與抗IgG 組非特異性抗體相比，結合于抗ALDOA 組ALDOA 抗體的RNA 中GK-IT1呈明顯富集，差異有統(tǒng)計學意義（圖7B，P=0.000），提示GK-IT1可能與ALDOA 蛋白相互作用。

圖7 GK-IT1與ALDOA的相互作用Fig 7 Interaction between GK-IT1 and ALDOA

2.9 ALDOA 過 表 達 對 敲 減GK-IT1 的NSCLC 細胞增殖、侵襲和遷移的影響

為了進一步明確GK-IT1是否通過ALDOA來調控NSCLC 細胞的增殖、侵襲及遷移，在A549 及H358細胞中進行過表達ALDOA的挽救實驗。CCK-8 實驗結果顯示，與Si-GK-IT1#2 組相比，Si-GK-IT1#2+ALDOA組的細胞增殖能力明顯增強（圖8A、B，均P<0.05）；EdU 實驗結果表明，Si-GK-IT1#2+ALDOA組細胞的EdU 陽性比例較Si-GK-IT1#2 組明顯升高，細胞增殖能力增強（圖8C，均P<0.05）；Transwell侵襲實驗結果表明， 與Si-GK-IT1#2 組相比，Si-GK-IT1#2+ALDOA組的細胞穿膜個數明顯增多，細胞侵襲能力增強（圖8D～F，均P=0.000）；細胞劃痕實驗結果說明，Si-GK-IT1#2+ALDOA組細胞的24 h 遷移率較Si-GK-IT1#2 組明顯升高，細胞遷移能力增強（圖8G～I，均P=0.000）。Western blotting結果顯示：Si-GK-IT1#2+ALDOA組細胞中ALDOA 和vimentin 蛋白表達水平均高于Si-GK-IT1#2 組，而E-cadherin 蛋白的表達水平低于Si-GK-IT1#2 組（圖9，均P<0.05）。

圖8 過表達ALDOA對敲除GK-IT1的NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移的影響Fig 8 Effects of ALDOA overexpression on the proliferation,invasion and migration of GK-IT1-knockdown NSCLC cells

圖9 過表達ALDOA對敲除GK-IT1的NSCLC細胞ALDOA及EMT相關蛋白表達的影響Fig 9 Effects of ALDOA overexpression on the expression of ALDOA and EMT-related proteins in GK-IT1-knockdown NSCLC cells

3 討論

lncRNA 可與RNA 結合蛋白或（和）轉錄因子等相互作用，影響信號通路轉導，是多種細胞生物學過程的重要調控因子［15-17］。例如，LINC01354通過其p3段與RNA 結合蛋白hnRNP-D 相互作用，調控β-連環(huán)蛋白基因CTNNB1的穩(wěn)定性，影響結腸癌細胞的增殖和轉移［18］。大量的lncRNA已被證實與腫瘤的發(fā)展密切相關，而GK-IT1在NSCLC中的作用機制尚不明確。本研究發(fā)現GK-IT1在NSCLC組織和細胞系中高表達；多項細胞功能實驗結果表明，敲減GK-IT1明顯抑制NSCLC 細胞的惡性進展。因此，尋找GK-IT1影響NSCLC疾病發(fā)展的潛在靶點或可作為新的探究方向。

ALDOA 在肺癌及胰腺癌等多種疾病中高表達，可增強NSCLC 的有氧糖酵解，促進細胞周期蛋白D1的表達、G1/S 期轉換和細胞增殖［19］。不僅如此，ALDOA 還可直接與lncRNAZNF674-AS1相互作用，發(fā)揮類似RNA 結合蛋白的作用，從而影響卵巢顆粒細胞的糖酵解和增殖［20］。通過生物信息學預測與RIP 實驗，我們發(fā)現lncRNAGK-IT1與ALDOA 存在相互作用。FISH 實驗結果提示GK-IT1主要位于細胞質，且ALDOA 也主要位于肺癌細胞的細胞質中［21］。由于細胞質中的lncRNA可通過與RNA結合蛋白相互作用來調節(jié)基因轉錄［22］。因此，GK-IT1可能通過與細胞質中ALDOA 蛋白結合來實現對NSCLC 細胞增殖、侵襲及遷移的調控。

EMT 是影響腫瘤細胞可塑性的重要因素［23］，也是腫瘤轉移的重要步驟和癌癥患者預后的獨立預測指標［24］。lncRNA或ALDOA均可對EMT進行調控，從而影響肺癌疾病進展。例如，lncRNAFEZF1-AS1通過Wnt 通路調節(jié)E-cadherin 的表達，誘導NSCLC 的EMT 發(fā)生及腫瘤轉移［25］；下調ALDOA可通過促進E-cadherin 表達，降低vimentin 表達來調控EMT，從而影響肺癌的腫瘤形成能力和遷移能力［21］。本研究結果顯示，敲低GK-IT1后，EMT 相關蛋白的表達水平受到影響（圖6）。前述生物信息學分析及RIP實驗結果提示GK-IT1與ALDOA 蛋白存在相互作用。過表達ALDOA的挽救實驗結果表明，敲低GK-IT1對細胞增殖、侵襲及遷移產生的影響被逆轉。因此，我們得出lncRNAGK-IT1可通過與細胞質中的ALDOA 相互作用，調控EMT 相關蛋白的表達，進而影響NSCLC細胞的增殖、侵襲及遷移。

綜上，GK-IT1在NSCLC 中高表達，可通過ALDOA 蛋白調節(jié)EMT 過程來影響NSCLC 的惡性進展。近年來對RNA 結合蛋白的研究發(fā)現，lncRNA 可通過泛素化或磷酸化參與蛋白質修飾［26-27］。GK-IT1是否通過上述方式調控ALDOA 還需進一步探討。如果能以GK-IT1與ALDOA的相互作用為切入點，研究出相應的靶向藥物，干擾糖酵解進程，或可為NSCLC的治療提供新的思路，進而可能改善疾病預后。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實驗均已通過重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的審核批準（文件號2020-732，日期2020-12-14）。所有實驗過程均遵照醫(yī)學倫理原則和《赫爾辛基宣言》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University （approval letter No. 2020-732， dated 12/14/2020）， and all experimental protocols were carried out by following the guidelines of principles of medical ethics andHelsinki Declaration. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻/Authors'Contributions

劉子楊、王小文參與了實驗設計；劉子楊、陳力參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LIU Ziyang and WANG Xiaowen. The manuscript was drafted and revised by LIU Ziyang and CHEN Li.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-02-23

·Accepted：2022-05-06

·Published online：2022-05-28