聽覺腦干植入豚鼠模型構建的標準化步驟及評價

周 祥， 潘金錫， 張欽杰， 李 蘊，3， 陳 穎，3， 譚皓月， 彭 飛， 黃 穗， 譚治平，吳 皓，賈 歡

1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200011；2.上海交通大學醫學院耳科學研究所，上海市耳鼻疾病轉化醫學重點實驗室，上海 200125；3. 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院聽覺植入中心，上海 200125；4.浙江諾爾康神經電子科技股份有限公司，杭州 311100

人工聽覺腦干植入（auditory brainstem implantation，ABI）是植入式聽覺重建中最尖端的技術［1-2］，可以克服人工耳蝸植入（cochlear implantation，CI）的禁忌，使重度以上耳聾患者重獲聲音感知。目前，全球已有超過2 000例患者接受ABI手術，其適應證最初僅針對2型神經纖維瘤病（neurofibromatosis type 2，NF2）患者。NF2為常染色體顯性遺傳病，患者最終會由于腫瘤的生長壓迫、手術切除或術后放射治療的實施而出現雙側聽神經損毀，無法因CI獲益，只能依賴ABI重建聽力［3］。隨后，ABI適應證逐步擴大到其他無法進行CI的非NF2耳聾患者。同時，ABI手術的年齡限制也從18歲以上下降至12月齡以上，對于先天性耳聾患兒的建議手術年齡也與CI相同［4］。然而，對ABI長期隨訪結果表明，其臨床獲益個體差異大［5］，且總體開放性言語感知不如CI理想。近年來，各研究團隊也不斷關注造成這種局限性的原因［6-7］；而ABI作為腦機接口的一員，有研究表明其性能與電極神經界面之間病理生理變化及轉歸息息相關［8］。因此，ABI電極植入后，電極與腦組織的關系也值得深入研究。

動物模型的建立是研究ABI植入后電極組織界面關系及改進電極性能的重要內容和手段。但因電極植入的靶點——耳蝸背側核（dorsal cochlear nucleus，DCN）為耳蝸神經向顱內延伸的聽覺核團，位于重要的生命中樞腦干處，小動物植入模型的建立由于耳蝸核尺寸、電極工藝、植入技術等限制因素而面臨極大的挑戰， 目前該領域尚無基于ABI 技術的小型動物長期植入模型。因此，本研究為構建成功率高、重復性好的小動物模型，進行了手術步驟的標準化分析，優化了一套完整詳細的建模標準化步驟，并在此基礎上觀察了電極神經界面，為今后探索長期植入效果欠佳的原因及優化電極方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性白化豚鼠23 只，年齡4～6 周，體質量200～400 g；其中20 只用于手術植入電極，3 只用于定量PCR （q-PCR）實驗中無干預對照。動物均購自上海實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK（滬）2020-0006，使用許可證號為20200006000969。

1.2 電極植入標準化步驟

1.2.1 麻醉 將白化豚鼠利用鹽酸替來他明唑拉西泮注射液（50 mg/kg）及噻拉嗪（25 mg/kg）腹腔注射麻醉，5～10 min起效，麻醉標準為豚鼠下肢夾捏反射消失，呼吸深慢，切開皮膚及分離頸部組織時無抵抗及肌肉顫動。若未達到滿意麻醉效果，可按麻醉劑量的1/4～1/3予以追加。

1.2.2 經聽泡暴露耳蝸圓窗 固定豚鼠頭部后，予以顱頂正中至耳后乳突切開皮膚（圖1A），逐層分離筋膜及肌肉，露出顱底孔狀骨質，即聽泡篩區（圖1B）。將豚鼠頭部稍向后側偏，用尖刀挑開聽泡薄弱骨質后，用直徑1.5 mm 鉆頭磨除聽泡骨質，暴露耳蝸底圈、耳蝸圓窗及中耳腔（圖1C）。

1.2.3 經迷路暴露DCN 定位耳蝸圓窗，向顱底方向繼續磨除聽泡骨質，見上半規管后更換直徑0.8 mm 鉆頭并調低鉆速，繼續磨除骨質直至腦膜（圖1C）。小心挑開腦膜后可見小腦絨球，用吸引器輕柔吸除部分絨球組織，可見上方小腦、下方腦干及隆起于腦干表面的DCN一側（圖1D）。

圖1 豚鼠ABI手術流程Fig 1 ABI surgical procedure in guinea pigs

1.2.4 記錄與測試電誘發聽性腦干反應（evoke auditory brainstem response，eABR）利用實驗動物連接聽覺誘發電位儀（海神醫療器械有限公司，中國）測試評估eABR。術中暴露DCN后，即將刺激電極分別置于耳蝸及DCN 表面予以電刺激，同時將記錄電極放置于顱頂，參考電極放置于左側乳突，接地電極放置于左下肢，記錄波形。

1.2.5 電極固定及術后護理 ABI 植入術采用的是依據豚鼠DCN 大小（約4.0 mm×2.0 mm）設計的專用ABI電極，由平板硅膠片和4 個刺激電極觸點組成（鉑銥合金，90∶10）；每個電極觸點上都引出一條鉑銥合金導線電極線與相應的刺激器刺激電路相連，電極觸點之間距離如圖所示（圖2）。術中及術后eABR 記錄均采用雙極刺激模式（Bipolar，BP），植入前電極進行環氧乙烷滅菌消毒。術中在DCN 處測試eABR 后，取適量止血棉固定電極頭端，肌肉填塞腦膜缺損，將電極導線用光固化膠固定于聽泡，并將電極頭端固定縫合至豚鼠背部后，將手術切口逐層縫合。

圖2 豚鼠專用ABI外形及電極局部示意圖Fig 2 Schematic diagram of ABI electrode for guinea pig

1.3 術后觀察及評估

1.3.1 一般情況評估 術后每日觀察生命體征，以及傷口有無出血、感染、腫脹等情況；記錄術后動物攝食、活動、生存時間及并發癥等情況。

1.3.2 電生理評估 術中暴露DCN 后分別記錄耳蝸及DCN 處eABR，于動物安樂死前再次記錄術后DCN 處eABR。實驗中電極陣列植入的標準：耳蝸處eABR 在電刺激觸發后出現4 波（Wave Ⅳ）即為有效，閾值定義為引出4 波振幅低于0.15 μV 時的刺激電流，潛伏期為刺激后至引出4 波正峰出現的時間；DCN 處eABR 在電刺激觸發后出現3 波（Wave Ⅲ）即為有效，閾值定義為引出3 波振幅低于0.15 μV 時的刺激電流，潛伏期為刺激后至引出3 波正峰出現的時間。

1.3.3 組織學觀察 于術后電生理測試后對動物行安樂死，心臟灌注后進行組織取材。包埋后48 h（n=1）進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H-E）染色評估。另在術后48 h（n=3）、7 d（n=3）、30 d（n=2）、180 d（n=1），經過上述心臟灌注后進行組織取樣，固定后進行梯度脫水。包埋后制成厚度為50 μm的冰凍切片并貼片于載玻片上。依次烤片、清洗、封閉后，加入封閉液配置的一抗溶液（1∶1 000稀釋），包括膠質纖維酸性蛋白（rabbit anti GFAP；Novus，美國）、小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白抗體（goat anti Iba-1；Abcam，英國） 及神經元核抗原抗體（mouse anti NeuN；Sigma，美國）；次日，清洗結束后加入封閉液配置的二抗溶液（分別為Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti goat IgG、Alexa Fluor 594-conjugated donkey anti mouse IgG 和Alexa Fluor 647-conjugated donkey anti rabbit IgG），均以1∶500 濃度稀釋。最后，用適量的含DAPI 的抗熒光淬滅劑封片。

1.3.4 q-PCR 分析 取術后48 h（n=3）、7 d（n=3）豚鼠，另取3 只未行手術的正常豚鼠為對照。過量麻醉后斷頭處死豚鼠，在無酶環境中快速進行雙側耳蝸核組織取材，置于消毒后離心管中；將快速制備的組織放入RNAnase （R0901；Sigma，美國） 中防止RNA 降解，放入勻漿機（JXFSTPRP-48，上海凈信）研磨勻漿（總運行時長37 s，運行7 s 后中斷3 s，頻率為65 Hz）。隨后按照TRIzol 法提取組織RNA，反轉錄成cDNA 后，使用SYBR Green Premix Pre Taq HS qPCR Kit 在熒光定量PCR 儀（Roche LightCycler 480；Roche，瑞士）中進行PCR 擴增。目的基因為白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和基質金屬蛋白酶9 （matrix metalloprotein-9，MMP-9），序列參照GeneBank 數據庫，引物由NCBI Primer-blast 設計，蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.4 統計學分析

使用Image J 軟件分別對耳蝸處和DCN 處eABR波形進行測量。通過GraphPad Prism v.8.0程序，采用方差分析（ANOVA）結合Bonferroni 檢驗（數據符合正態分布且方差齊性）或Kruskal-Wallis 檢驗進行數據統計。采用Turkey post-hoc 檢驗比較組間以及各時間點差異。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

手術過程中無豚鼠死亡，均順利完成ABI 手術，平均手術耗時為（89.25±8.45）min（n=20）。術后急性期（0～7 d）死亡率為20%（n=4），集中在術后36～48 h。其中，3 只術后未恢復攝食反射；另1 只蘇醒后恢復攝食，但在48 h 時死亡。其余16 只動物均在術后24 h 恢復攝食反射，恢復期未見傷口明顯出血、感染等；在術后48 h 內有輕微平衡障礙，后逐漸恢復；未見腦脊液漏等其他明顯并發癥。

2.2 電生理結果

術中20 只豚鼠均成功引出耳蝸處及DCN 處eABR，除1只動物外，其余術中耳蝸處eABR在電刺激后引出4個正波，其形態與DCN 處引出eABR 類似（圖3），且后者在電刺激后引出3 個正波。耳蝸處eABR 中Ⅳ波潛伏期為（2.57±0.21）ms（n=19），閾值為（0.59±0.10）mA（n=19）。術中DCN 處Ⅲ波潛伏期為（1.74±0.13） ms （n=20），閾值為（0.50±0.09）mA（n=20）。術中DCN 處eABR中Ⅲ波相較術中耳蝸處eABR 中Ⅳ波潛伏期縮短（0.84±0.22）ms（n=19），DCN 處相比耳蝸處閾值降低（0.11±0.14）mA（n=19）。術后對動物在不同時間點行安樂死前記錄DCN 處eABR 波形，Ⅲ波潛伏期為（1.92±0.20）ms（n=16），閾值為（0.59±0.10）mA（n=16）。術后DCN 處eABRⅢ波與術中比較，潛伏期延長（0.19±0.22） ms （n=16）， 閾 值 增 加（0.03±0.32） mA（n=16）。

圖3 術中及術后eABR波形圖Fig 3 eABR waveform elicited intraoperatively and postoperatively

2.3 DCN組織學變化

對電極植入后不同時間點DCN 組織進行免疫熒光染色分析，可見電極刺激并植入后DCN 表面仍保持完整結構。其中術后48 h進行H-E染色發現，植入側與未植入側比較，耳蝸核及相鄰腦干組織出現類似組織空泡樣改變，即變性細胞的胞質出現大小不一的空泡，組織整體呈蜂窩樣或網狀改變（圖4）。在術后7 d 的免疫熒光染色中也發現植入側耳蝸核易與腦干連接部分出現分離。自術后48 h起，植入側的耳蝸核表面即出現膠質成分增多，術后180 d 仍較為明顯（圖5）。神經元密度在術后各時間點內未見明顯改變。

圖4 術后雙側耳蝸核及腦干組織H-E染色Fig 4 H-E staining of bilateral cochlear nuclei and brainstem tissues after operation

圖5 術后DCN免疫熒光染色圖Fig 5 Immunofluorescence staining of postoperative DCN

2.4 IL-1β和MMP-9基因表達變化

對電極植入術后48 h 及7 d 動物DCN 組織進行q-PCR 分析后發現，植入電極豚鼠（n=3）IL-1β和MMP-9基因表達量在術后48 h、7 d 時比未植入電極的對照豚鼠（n=3） 升高，但差異無統計學意義（圖6）。

圖6 q-PCR檢測豚鼠電極植入后DCN部位IL-1β和MMP-9 mRNA表達量Fig 6 mRNA expression of IL-1β and MMP-9 in DCN after implantation in guinea pigs by q-PCR

3 討論

ABI 作為目前人工聽覺植入最尖端的技術之一，為那些無法通過CI 獲得聽力的患者帶來了希望。但ABI 的臨床獲益始終不盡如人意，如何提升ABI性能始終是研究重點［7，9-11］。新式電極的研發、電極性能的測試或電極植入后微環境的觀察及改善，都離不開動物模型。

在穿透性ABI 電極相關論著中，OTTO 等［12］利用貓這一聽覺系統與人最為相似的物種進行研究，手術方式上同樣利用經聽泡-迷路徑路，將穿透式電極植入靠近聽神經根部的耳蝸腹側核處（ventral cochlear nucleus，VCN）。而 后，GUEX 和KOZIN等［6，13］圍繞柔性ABI 電極的開發，先后利用小鼠、大鼠，通過顱底徑路吸除小腦暴露DCN 表面的方式植入電極。另外，非人靈長類動物也是ABI臨床前測試中不可或缺的動物模型物種［14］。豚鼠模型的優勢在于成本低，動物較易獲得，耳蝸核大小適中；且在耳蝸核結構相關研究中也證實，不論是神經元分布或DCN 組織結構，豚鼠都比大鼠更接近于貓［15］。在手術徑路上，盡管早期已有文獻［16-17］利用豚鼠經聽泡-迷路徑路，依據聽神經走行判斷DCN 位置，但對豚鼠的相關解剖學研究［18-19］顯示，豚鼠聽神經與腦干耳蝸核之間存在一定程度的夾角，且具有個體差異。另外，DCN 表面隆起腦干1.5 mm 高度，因此，直接通過聽神經尋找DCN 的困難與創傷程度不言而喻。在本研究中，我們在術中盡量避免損傷聽神經，通過辨認豚鼠上半規管、側顱底與第四腦室關系，在可視狀態下暴露DCN 表面后植入電極。這不僅提高了動物建模的有效率，也大大保障了植入過程不因視野受限而導致電極或器械損傷柔軟的腦組織。

腦干為重要的生命中樞，且電極植入靶點鄰近后組顱神經，因此術中應注意監測呼吸、心跳以預防相關并發癥。若電刺激引出其他非聽覺反應，則會在eABR 波形上表現為5 ms左右高聳寬大的波形；而本研究中的eABR 波形中未觀察到此現象，因此排除其他反應的產生。術后發生的死亡事件集中在36～48 h，猜測可能是由于電極植入腦干后移位，對呼吸、心率、體溫，甚至攝食反射產生影響所致，或因豚鼠DCN 表面毗鄰前庭核［18-19］，影響其進食所致。后續改進可增加術后制動、電極固定及監護，以期進一步提高豚鼠植入后生存質量。

在ABI相關研究中，術中DCN處引出典型eABR波形能夠說明電極位置的準確性［20］；且在豚鼠實驗中，刺激DCN 后引出的第三個正波（Ⅲ波）較為穩定［21］，波形與前人研究基本一致［16，22］。在本研究結果中，暴露DCN后仍能順利引出耳蝸eABR，可驗證該術式及操作未損傷聽神經，且兩處eABR 波形相似也同時驗證電極均成功放置于DCN表面。術后eABR相較術中，在閾值和潛伏期上稍有延后，猜測可能與術后電極組織界面因纖維化、膠質增厚或電極稍有移位有關［23］。

目前在腦機接口相關研究中發現，植入腦組織的皮質電極存在性能不穩定問題，可能由于電極表面涂層退化、電極植入后引出急性炎癥、局部膠質成分激活有關。尤其是圍繞電極周圍形成包裹鞘的星形膠質細胞與小膠質細胞［24-27］，研究其在ABI 植入后的激活、清除、極化的動態變化，對于提升ABI電極的性能極有幫助。本研究觀察到植入后48 h起，局部星形膠質細胞與小膠質細胞開始增多，與先前針對皮質內插入式相關研究的發現一致［23］。此外，在術后48 h樣本中，植入側可觀察到耳蝸核及相鄰腦干區域的空泡樣改變，這與早前在沙鼠的噪音暴露后的耳蝸核海綿樣改變相似［28］。我們猜測該現象可能為電刺激后的興奮毒性改變，即激活過多興奮性氨基酸神經遞質，引發了細胞水腫或線粒體損傷。q-PCR 結果顯示48 h 時出現IL-1β的激活。由于該細胞因子由活化的巨噬細胞作為前蛋白產生，而膠質增生的激活來源于巨噬細胞作用，說明ABI植入后局部有膠質活動。另外，MMP-9基因在48 h 也出現升高。由于這一基因功能是降解和重塑細胞外基質的動態平衡，參與維持血腦屏障的完整性［29］，因此說明即使ABI 板狀電極未侵入組織深部，但同樣引發了血腦屏障的破壞。

綜合考慮到實驗周期及成本（條件反射訓練等），本研究中未采用行為學測試進行驗證。雖然行為學測試能更好地評估聽覺功能，但通常聽覺電生理也能反映聽覺植入裝置的有效性［30］。此外，本次實驗樣本量較少，雖然觀察到組織學疑似變化，但需后期加大樣本量進一步驗證。因為本研究中，動物并發癥少，eABR 反應好，電極組織界面理想，仍足以驗證該動物模型的可靠性和有效性。

由于ABI手術難度大，且適合人群范圍窄（適用于NF2、耳蝸/蝸神經嚴重畸形等罕見病患者），并涉及多學科領域，國內外基礎及臨床研究團隊較少。但由于我國人口基數較大，罹患這類疾病的患者數量仍然較多，且該方向與腦科學、腦機接口等前沿領域關系密切，因此值得深入研究。未來ABI的研究方向應當向柔性電極、表面修飾、電刺激策略等方面發展。構建成功的動物模型，無疑是相關研究得以開展的重要基石。

綜上，本研究改良構建的經聽泡-迷路徑路ABI植入豚鼠模型安全可靠。術后急性期、短期可觀察到ABI 電極組織界面的變化，尤其是膠質成分的增多，及其對聽覺電生理閾值與潛伏期的影響。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動物實驗均已通過上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院倫理委員會的審核批準（審批號SH9H-2021-A538-SB）。所有實驗過程均遵照上海交通大學醫學院實驗動物倫理委員會相關條例進行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Shanghai Ninth People’s Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （Approval Letter， SH9H-2021-A538-SB， dated 22/02/2021）， and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of Experimental Animal Ethics Committee of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

作者貢獻/Authors'Contributions

周祥參與了數據采集和分析、論文撰寫；潘金錫、張欽杰參與了數據處理、論文修改；李蘊參與了聽覺電生理測試指導；陳穎參與了聽覺電生理測試；譚皓月參與了論文修改；彭飛、黃穗、譚治平參與了實驗及電極設計；吳皓參與了實驗指導；賈歡參與實驗設計、監督及論文修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。ZHOU Xiang acquired and analyzed the data， and drafted the manuscript. PAN Jinxi and ZHANG Qinjie analyzed and interpreted the data， and revised the manuscript. LI Yun guided the auditory electrophysiological test. CHEN Ying participated in the auditory electrophysiological test. TAN Haoyue revised the manuscript. PENG Fei， HUANG Sui， and TAN Zhiping participated in the experiment and electrode design. WU Hao participated in the experimental study guidance. JIA Huan conceived and designed the study supervision and manuscript correction. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-27

·Accepted：2022-04-15

·Published online：2022-05-28