長鏈非編碼RNA-B230352I09 表達改變對H9C2 心肌細胞增殖及周期的影響

徐斐翔，汪 升，薛明明，童朝陽，陳玉梅

復旦大學附屬中山醫院急診科，上海 200032

心力衰竭是心血管疾病的終末階段，其患病率的不斷上升，對醫療保健系統和經濟發展產生巨大影響［1］。研究［2］表明，心肌細胞數量減少是心肌梗死等心肌損傷因素導致心力衰竭的主要原因。因此，提高心肌細胞增殖能力成了心臟疾病治療的關鍵。

近年來大量研究發現長鏈非編碼RNA （long noncoding RNA，lncRNA）參與調控心肌細胞增殖，在心臟再生醫學中具有重要意義［3］。如lncRNA NR_045363 通過與微RNA（microRNA，miR）-216a的相互作用刺激心肌細胞增殖并改善心肌功能［4］。lncRNA of Dachshund Homolog 1（lncDACH1）在出生后的小鼠心臟中表達升高，心臟特異性過表達lncDACH1可抑制心臟再生，敲除lncDACH1可以重新激活心肌細胞增殖潛力；lncDACH1通過直接與蛋白磷酸酶1 催化亞基α 結合，增加心肌細胞增殖，促進心肌再生［5］。然而，現有lncRNA 數據資源有限，仍需大量研究探索其參與心肌細胞增殖的生物學功能和分子機制。

lncRNA-B230352I09 是一條功能未知的lncRNA，在新生1 d 的小鼠心臟組織高表達，但在7 d 的小鼠心臟組織中幾乎不表達［6］。相關研究［7］表明，出生1 d 的小鼠在心尖切除手術后心肌細胞仍具有增殖能力，損傷心肌能完全恢復；而出生7 d的小鼠接受同樣手術后，心肌細胞卻喪失了增殖的能力。因此，我們推測lncRNA-B230352I09 可能參與心臟再生過程。本研究擬通過H9C2 心肌細胞探索lncRNA-B230352I09 對心肌細胞增殖及周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 H9C2 細胞 鼠胚胎心肌細胞H9C2 購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.1.2 試劑與儀器 無菌超凈臺、細胞培養箱、生物安全柜（Thermofisher公司，美國），DMEM 培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco 公司，美國）；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、探針、定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（Life Technology公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8，CCK8）、陽離子脂質體Lipofectamine 3000 （Lipo3000）、5-乙 炔 基-2'-脫 氧 尿 嘧 啶（5-ethynyl-2'-deoxyuridine， EdU） 免 疫 熒 光 試 劑 盒（Invitrogen公司）；細胞周期檢測試劑盒（凱基生物公司，中國）；實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）儀（ABI公司，美國）；流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 H9C2 心肌細胞培養 將大鼠的H9C2 心肌細胞接種于培養皿中，常規培養于含有10%FBS 和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 完全培養基中。培養條件：37 ℃、5%CO2和95%飽和濕度。間隔1 d 更換新鮮培養基，待細胞貼壁生長融合度達到80%后，進行傳代培養，用于后續試驗。

1.2.2 細胞轉染 lncRNA-B230352I09 過表達質粒（pcDNA-B230352I09）和陰性對照（negative control，NC）載體（pcDNA-NC）由上海吉瑪生物公司合成。取對數生長期的細胞接種于6 孔細胞培養板，待細胞融合度達50%～60%時更換無血清培養液，加入轉染質粒和Lipo3000 轉染液，培養6 h 后更換新鮮培養基繼續培養。實驗分為空白對照組（無任何處理）、陰性對照組（轉染pcDNA-NC）、lncRNA-B230352I09過表達組（轉染pcDNA-B230352I09）。

1.2.3 細胞增殖檢測 CCK8 法：將處于對數生長期，細胞狀態良好的細胞按照3 000 個/孔的密度接種于96孔板中，隨后分別于轉染24 h、48 h和72 h加入CCK8 溶液，孵育2 h 后置于酶標儀，測量450 nm 波長的吸光度（optical density，OD）值，繪制生長曲線。每個樣品重復測量3 次。EdU 檢測：化學試劑EdU 可以特異地結合到新合成的DNA 中并被熒光顯微鏡檢測，用來評估細胞增殖情況。將培養的H9C2細胞進行EdU 標記、固定、洗滌和通透，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）細胞核染色后，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 細胞周期檢測 轉染后72 h 用胰蛋白酶消化并收集細胞，70%乙醇、20 ℃固定過夜，固定好的細胞使用碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色液染色，于流式細胞儀檢測細胞周期中G1期、S期、G2期細胞比例變化。每個樣品重復測量3次。

1.2.5 RT-PCR 檢測 用RNA 提取試劑盒提取總RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA 模板，GAPDH為內參，分別設計擴增基因的引物，其中lncRNA-B230352I09 的正向引物序列為5'ATCACAA CAATCCCTTCCAC3'，反向引物序列為5'GCAACA GAAAAGAAACCAAGA3'。細胞周期蛋白（cyclin D1）正向引物序列為5'GCCCTCCGTTTCTTACTTCA 3'，反向引物序列為5'CTCCTCTTCGCACTTCTGCT 3'。細胞周期蛋白依賴性激酶1 （cyclin dependent protein kinase 1，CDK1） 正 向 引 物 序 列 為5'TCTTCGCTCGTTAAGAG TTAC3'，反向引物序列為5'ATCTGCCAGTTTGATT GTTC3'。GAPDH正 向引物序列為5′GACCTGACCT GCCGTCTA3′，反向引物序列為5′AGGAGTGGGT GTCGCTGT3′。PCR儀上進行擴增，反應條件：95 ℃，10 min 預變性，95 ℃15 s，60 ℃1 min，重復40 個循環。結果用2-ΔΔCT方法進行分析。實驗獨立重復3次。

1.2.6 統計學分析 采用GraphPad Prism 8.0 軟件對數據進行統計分析處理，數據以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行F檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR 檢 測lncRNA-B230352I09 過 表 達效率

空白對照組、陰性對照組及lncRNA-B230352I09過表達組3 組間lncRNA-B230352I09 表達水平，差異具有統計學意義（P=0.000），其中空白對照組和pcDNA-NC 組相比，lncRNA-B230352I09 的表達，差異無統計學意義；與pcDNA-NC 組相比，lncRNAB230352I09過表達組中lncRNA-B230352I09表達水平顯著升高，差異具有統計學意義（P=0.000），提示轉染構建成功（圖1）。

圖1 lncRNA-B230352I09過表達效率的檢測Fig1 Detection and validation of lncRNA-B230352I09 overexpression efficiency

2.2 lncRNA-B230352I09 過 表 達 對H9C2 細 胞 增殖的影響

CCK8檢測顯示：在不同時間點（24 h、48 h、72 h）3組細胞增殖能力差異均具有統計學意義（P=0.000）；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-B230352I09過表達組表現為明顯的時間依賴性細胞增殖能力增強（圖2A），差異均具有統計學意義（24 h：P=0.000；48 h：P=0.000；72 h：P=0.001）。熒光顯微鏡下觀察EdU標記陽性細胞，結果顯示pcDNA-B230352I09過表達組EdU陽性細胞比例明顯高于對照組（圖2B）。

圖2 lncRNA-B230352I09過表達對心肌細胞增殖的影響Fig 2 Effect of lncRNA-B230352I09 overexpression on proliferation of cardiomyocytes

2.3 lncRNA-B230352I09 過 表 達 對H9C2 細 胞 周期的影響

轉染72 h 后檢測細胞周期，如圖3A 所示，3 組在G1期和S 期細胞比例差異具有統計學意義（P＝0.000），在G2期細胞比例的差異無統計學意義；其 中pcDNA-NC 組G1期 細 胞 比 例 為（57.99±0.09）%，S 期為（25.78±0.1）%，G2期為（16.23±0.06）%；pcDNA-B230352I09 過表達組G1期細胞比例為（52.19±1.3）%，S 期為（31.72±1.2）%，G2期為（16.09±0.15）%。和pcDNA-NC 組相比，pcDNAB230352I09過表達組G1期細胞比例減少，S期細胞比例明顯增加，差異具有統計學意義（均P＝0.000）。進一步利用RT-PCR 檢測心肌細胞cyclin D1 和CDK1的mRNA表達情況發現：3組間基因mRNA 表達差異具有統計學意義（均P＝0.000）；與pcDNA-NC 組比較， pcDNA-B230352I09 組cyclin D1 和CDK1的mRNA 表達水平顯著升高（圖3B），差異具有統計學意義（均P＝0.000）。

圖3 lncRNA-B230352I09過表達對心肌細胞細胞周期的影響Fig 3 Effect of lncRNA-B230352I09 overexpression on cell cycle of cardiomyocytes

3 討論

預防心力衰竭的理想手段需要補償丟失的心肌細胞，然而，一些研究［8］已經確定心臟中沒有心臟干細胞，且新增心肌細胞來源于現有的心肌細胞。因此，尋找成熟心肌細胞的增殖調控因素成為研究學者的焦點。已有大量研究［9］表明可以通過調節細胞周期轉錄因子、非編碼RNA、細胞外基質和細胞結構、多種信號通路如Hippo 和NRG-1/ErbB 通路等促進心肌細胞增殖，提示誘導成熟心肌細胞增殖能力的激活是促進內源性心臟修復和預防心力衰竭的可行方法。本研究從細胞增殖的角度探討lncRNA-B230352I09在心肌細胞中的作用。實驗采用CCK8 法間接測定心肌細胞增殖數量，EdU 檢測心肌細胞的DNA 合成情況。結果表明lncRNA-B230352I09 過表達的心肌細胞數量、DNA合成均明顯增加，提示lncRNA-B230352I09能夠促進心肌細胞增殖和分裂。

目前普遍認為心肌細胞終末分化時變成雙核細胞而“退出”細胞周期，不再增殖［10］，故成年心肌細胞增殖的關鍵過程是使其重新進入細胞周期。細胞周期的進行取決于細胞周期蛋白和CDK 的協調反應，調節DNA 合成和細胞分裂。在出生后心臟生長期間，心肌細胞周期活動開始減少，伴隨細胞周期蛋白和CDK 的表達減少［11］。因此，靶向調節細胞周期促進心肌細胞增殖是心臟再生的有效方法。研究［12］顯示，CDK1、CDK4、cyclin B1 和cyclin D1的過表達明顯促進小鼠、大鼠和人心肌細胞的細胞分裂，減少心肌損傷后瘢痕的形成。其中cyclin D1是G1期細胞增殖信號的關鍵蛋白，可誘導細胞進入S 期［13］。在 本 研 究 中 發 現，lncRNA-B230352I09 過表達的H9C2 心肌細胞CDK1和cyclin D1 的mRNA 水平明顯增加；且流式細胞儀檢測顯示lncRNAB230352I09 可促進心肌細胞進入S 期。因此，我們得出結論：lncRNA-B230352I09 能夠通過調節cyclin D1 和CDK1，促進心肌細胞進入S 期，增強心肌細胞增殖能力。

本研究仍存在不足之處：①H9C2 心肌細胞［14］來源大鼠胚胎心臟組織，雖然作為心臟疾病常用研究對象，但不能真實反映原代心肌細胞的生物性狀及人體成熟心肌細胞的狀態，需要進一步驗證。②本研究僅觀察到lncRNA-B230352I09 對H9C2 心肌細胞常規培養狀態下增殖表型的作用，對其損傷刺激狀態下的表型變化有待進一步探索。

本實驗研究結果表明，lncRNA B230352I09 有可能通過促進心肌細胞增殖成為維持心臟結構和改善心臟功能的潛在有效途徑。 本研究為lncRNAB230352I09 在缺血缺氧損傷心肌細胞中的研究奠定了一定基礎，為應用于慢性心力衰竭等心臟疾病的治療提供了一定理論依據。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

陳玉梅、童朝陽參與了實驗設計；徐斐翔、汪升參與了實驗的具體執行；徐斐翔、汪升、薛明明參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by CHEN Yumei and TONG Chaoyang. The experiments were performed by XU Feixiang and WANG Sheng. The manuscript was drafted and revised by XU Feixiang， WANG Sheng and XUE Mingming.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-02-14

·Accepted：2022-05-16

·Published online：2022-05-28