一次性尿多巴胺生物醫學傳感器研發*

朱春楠,陳道明,劉曉軍,劉 超,張朱珊瑩,鄭冬云

(1.中南民族大學 生物醫學工程學院,湖北 武漢 430074；2.醫學信息分析及腫瘤診療湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430074；3.腦認知科學實驗室國家民委重點實驗室(中南民族大學),湖北 武漢 430074)

0 引 言

多巴胺(dopamine,DA)是哺乳動物中樞神經系統中的一種重要神經遞質[1],在維持機體正常的記憶、學習、注意力和運動能力方面發揮著重要功能[2]。其在血液及尿液中的正常濃度范圍分別為0.1～0.4 nmol/L及0.1～2.0 μmol/L[3],濃度異常可導致帕金森病[4]、阿爾茨海默病[5]、精神分裂癥[6]、高血壓和肥胖等[7]。因此,生物樣本中DA含量的準確、快速檢測對于相關疾病的診斷具有重要的臨床意義。

已見報道的DA檢測方法包括有化學發光法[8]、分光光度法[9]、拉曼散射光譜法[10]、電泳法[11]以及高效液相色譜法[12]等,方法準確度和靈敏度高,但儀器昂貴,需耗時復雜的樣品前處理過程,且對儀器操作人員要求較高。為滿足社區醫院和家庭自檢的需求,開發成本低且易操作的DA生物醫學傳感器非常必要。電化學傳感法恰好可以彌補上述方法的不足[13,14],是一個理想的選擇。

本文采用成本低廉的一次性移液槍槍頭、石墨粉及石蠟油自制了石墨碳糊微電極(graphite carbon paste microelectrode,GCPME),并通過簡單可控的吸附法,將陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)固定于電極表面,制得CTAB/GCPME。將CTAB/GCPME用于DA的檢測,性能良好且適用于尿DA的準確快速分析,可用作一次性尿DA生物醫學傳感器。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

DA和尿酸(UA)均購自Sigma公司,CTAB購自上海試劑公司。石墨粉、石蠟油、無水乙醇、NaOH、HCl、NaH2PO4、Na2HPO4、KCl、NaNO2、CaCl2、K2Fe(CN)6和K3Fe(CN)6均購自國藥集團化學試劑有限公司。

電化學實驗均在CHI660D電化學工作站上完成,采用傳統的三電極系統：裸GCPME或CTAB/GCPME為工作電極,飽和甘汞電極(saturated calomel electrode,SCE)為參比電極,鉑電極為對電極。CHI660D電化學工作站、SCE以及鉑電極均購自上海辰華儀器有限公司。pHS-3E酸度計(上海佑科儀器儀表有限公司)用于調節溶液pH值。KQ3200DB超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司)用于工作電極的清洗及溶液的混合。PGUV-10-AS超純水儀(武漢品冠儀器設備有限公司)用于實驗用超純水的制備。

1.2 DA電化學傳感器的制備

裸GCPME的制備：首先,將直徑為500 μm的銅絲穿入尖端直徑為200 μm的一次性移液槍槍頭塑料管內,并用AB膠將銅絲和槍頭尾端固定；然后,稱取100 mg石墨粉,并置于瑪瑙研缽中與16 μL石蠟油混合,充分研磨制得石墨碳糊；最后,將石墨碳糊擠壓進槍頭尖端,并在稱量紙上磨平,即制得GCPME。

CTAB修飾GCPME的制備：將制備好的GCPME置于10 mmol/L CTAB水溶液中浸泡吸附30 min,蒸餾水清洗,自然晾干,即制得CTAB修飾的GCPME(CTAB/GCPME),其制備過程及對DA的電催化響應機制示意圖如圖1所示。

圖1 CTAB/GCPME的制備過程及其對DA的傳感響應示意

2 結果與討論

2.1 傳感器制備與使用條件優化

為確保CTAB/GCPME用于DA檢測時擁有良好的性能,首先對CTAB/GCPME的制備條件和使用條件進行了優化,包括CTAB吸附時間、富集時間和富集電位。根據圖2所示的實驗結果,確定了以下條件：a.CTAB的最佳吸附時長為30 min；b.最佳富集時間為150 s；c.最佳富集電位為1.5 V。

圖2 CTAB吸附時間、富集時間和富集電位對DA傳感響應的影響

2.2 DA在不同電極上的電化學響應

借助于循環伏安法,對傳感器的催化性能進行了考察,結果如圖3所示。當底液中沒有DA時,傳感器無響應(圖3,線a)；當底液中含有4.0×10-4mol/L DA時,在裸GCPME上,僅出現一對微弱的電化學響應信號(圖3，線b)；而在CTAB/GCPME上,可觀察到一對明顯的氧化還原峰,峰形尖銳,峰電流明顯增大(圖3，線c),這表明DA在傳感器上的電化學反應是一個可逆過程,而且CTAB對DA的電化學響應具有明顯的增敏效應。

圖3 DA在不同電極上的電化學響應對比

2.3 不同電極的表面形貌表征

為探究傳感器對DA的增敏機制,采用掃描電鏡(SEM) 技術,對不同電極的表面形貌進行了表征,結果如圖4所示。裸GCPME表面緊實平整(圖4(a))；吸附CTAB后,電極表面變得支離破碎且疏松多孔(圖4(b)),這對增大電極有效表面積,從而進一步增加DA在電極表面的富集量,有效提高傳感器的響應靈敏度非常有利。

圖4 裸GCPME以及CTAB/GCPME的掃描電鏡圖

2.4 DA在傳感器上的電化學反應機理探討

2.4.1 掃描速率對DA電化學響應的影響

為闡明DA在電極表面反應的動力學過程,采用線性掃描伏安法,考察了不同掃描速率下,DA在CTAB/GCPME上的電化學響應,結果如圖5(a)所示。在25～300 mV/s的掃描速率范圍內,DA的氧化峰電流(Ip)與掃描速率的平方根(v1/2)呈線性相關：Ip=0.18v1/2-0.44,R2=0.993(圖5(b)),說明DA在傳感器上的電化學氧化是一個受擴散控制的準可逆過程。根據Heyrovsky-Ilkovic理論[15],對于一個受擴散控制的準可逆電化學反應,峰電位與掃描速率的自然對數之間應遵循以下公式

圖5 掃描速率對DA電化學響應的影響

(1)

式中E1/2為半峰電位(V),R為氣體常數,n為電子轉移數,F為法拉第常數。根據式(1),可以計算出電子轉移數為n=2,故DA的電化學氧化反應是受擴散控制的二電子轉移過程。

2.4.2 底液酸堿度對DA電化學響應的影響

底液酸堿度是影響DA電化學反應的一個重要因素,因為DA在溶液中的解離狀態以及電極表面的荷電狀態都與之密切相關。采用線性掃描伏安法,考察了底液酸堿度對DA電化學響應的影響,結果如圖6(a)所示。在底液pH值從2.0增大至9.0的過程中,DA的氧化峰電流(Ip) 先增大后減小,在底液pH值為6.0時,達到最大(圖6(b))。這是因為此時的DA解離狀態以及電極表面的荷電和形貌狀態更有利于DA在電極表面的富集。另一方面,DA的氧化峰電位(Ep) 隨著底液pH值的增大而減小,且與底液pH值呈良好線性關系：Ep=0.66-0.059 pH,R2=0.991(圖6(c)),說明DA在GCPME上的電化學反應過程有質子參與。結合關系式：Ep=K-0.059(m/n)pH(公式中K為常數,m為反應中轉移的質子數,n為轉移的電子數)可知,當DA在GCPME上發生電化學反應時,轉移質子數與電子數相同。

圖6 底液pH對DA電化學響應的影響

2.5 傳感器的性能測試

2.5.1 線性范圍、靈敏度和檢出限

采用線性掃描伏安法,對傳感器的線性范圍、靈敏度和響應時間進行了考察,結果如圖7(a)所示。數據分析處理可得,在2.0×10-7～1.0×10-5mol/L及1.0×10-5～1.0×10-4mol/L的濃度范圍內,DA的氧化峰電流與其濃度呈良好線性關系,所對應的線性方程分別為：Ip(μA)=0.092+0.33c(μmol/L),R2=0.99(圖7(b))；Ip(μA)=2.38+0.12c(μmol/L),R2=0.99(圖7(c)),傳感器靈敏度為0.33 μA/(μmol/L),檢出限為4.0×10-8mol/L(S/N=3)。

圖7 DA傳感器的線性考察

2.5.2 特異性

特異性是衡量傳感器性能的重要指標之一,良好的特異性是保證傳感器高準確性的前提。尿液樣品成分復雜[16],除含有DA外,還含有抗壞血酸和尿酸等正常代謝產物以及無機鹽離子,因此,考察這些共存物是否會對DA的檢測產生干擾,非常必要。本文借助于線性掃描伏安法,對DA傳感器的特異性進行了評價,結果表明,50倍濃度的亞硝酸鈉(NaNO2)、氯化鈣(CaCl2)以及5倍濃度的抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)均未對DA的測定產生明顯干擾,表明DA傳感器具有良好的特異性。

2.6 實際樣品分析

通過將DA傳感器應用于健康人尿樣的檢測,對其準確性進行了評價。采用線性掃描伏安法進行實驗,運用標準加入法進行分析,結果如表1所示。測定回收率在97.9 %～101.3 %之間,平均回收率為99.1 %；每個樣品平行測定5次,相對標準偏差均小于4.0 %,表明所研發的一次性DA傳感器可應用于生物醫學樣品中DA含量的準確檢測分析。

表1 健康人尿樣中DA的測定(n=5)

3 結 論

以成本低廉的移液槍槍頭自制電極空腔,以石墨碳糊為填充材料,以表面活性劑CTAB為增敏劑,研發了一種一次性尿DA生物醫學傳感器。借助于電化學分析技術對傳感器的制備條件和使用條件進行了優化,通過掃描電鏡技術對傳感器的響應機理進行了探討。性能評價結果顯示,傳感器具有線性范圍寬、靈敏度高、響應時間短、特異性好等優點,且可直接用于尿液中DA含量的快速準確檢測。此外,傳感器還具有制備方法簡單、操作簡便、成本低廉、便于批量生產等優勢,可為DA相關疾病的早期篩查及臨床診療提供有效檢測工具,具有良好的生物醫學應用前景。