基于微流控芯片構建復合力學刺激細胞反應器*

敬靈芝,范蘇娜,2,姚 響,張耀鵬,2

(1.纖維材料改性國家重點實驗室 東華大學 材料科學與工程學院，上海 201620； 2.濟南金泉生物科技有限公司，山東 濟南 250101)

0 引 言

伴隨著人體運動，不同部位的各組織總是處在各種復雜的力學微環境中[1]。例如，血液的流動將使血管中的上皮細胞和內皮細胞不斷受到流體的剪切，剪切力隨著血液流速的變化而發生改變[2]；呼吸過程中肺部的收縮與擴張亦會使肺泡上皮細胞處于周期性的拉伸作用中[3]；而存在于膝關節和髖關節等承重關節中的關節軟骨在運動過程中則會不斷受到關節滑液傳遞的靜水壓刺激[4]，諸如此類存在于機體內的力學刺激不勝枚舉。

已有諸多研究報道指出細胞在體外對單一的流體剪切[5～7]、拉伸作用[8,9]、壓力[10,11]等力學刺激均會做出明顯響應，此類力學刺激—細胞響應相關的基礎研究工作對諸如動脈粥樣硬化[12,13]、肺部炎癥反應[14]、骨關節炎[15,16]等疾病的發病機理與治療方案探索均有重要參考價值。然而，體內的力學微環境往往不是某種力的單一存在。研究復合力學刺激對細胞行為的影響可更為貼切地模擬體內的實際力學微環境。但目前相關的研究報道還相對較少，主要原因很可能在于適宜于細胞培養的相關復合力學刺激設施設備較為缺乏。眾所周知，微流控芯片[17,18]簡潔小巧、可利用微結構設計準確操控流體，模擬細胞在體內的部分受力情況[19～21]。

綜合上述分析，本文擬借助微流控芯片技術及相關基材的表界面修飾技術來構建適宜于細胞灌流培養的微流控通道，進一步整合可控的灌流和壓力施加系統來構建對細胞可同時施加流體剪切力和壓力的復合力學刺激細胞反應器。此外，通過在微通道中植入壓力傳感器還可賦予體系實時傳感細胞培養通道中實際壓力信號的功能。本文擬開發的細胞反應器簡便小巧，有望用于研究流體剪切力—壓力復合刺激對細胞或微組織行為的影響。

1 試 驗

1.1 原 料

聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)預聚物及固化劑(美國Dow Corning公司)；SU—8 2000光刻膠(Microchem)；光纖光柵傳感器(上海漢坤光電科技有限公司)；α—MEM低糖培養基(Gibco)；胎牛血清(FBS)(Gibco)；青鏈霉素雙抗(Gibco)；胰蛋白酶(Gibco)；粘附因子(attachment factor)，(Invitrogen)；I型膠原(Collagen I)(杭州欣友生物技術有限公司)；纖連蛋白(fibronectin)，(Roche)；大鼠骨髓基質干細胞(美國澳賽爾斯生物技術(上海)有限公司)。

1.2 儀 器

勻膠機 TJ800型(北京中科同志科技有限公司)；紫外光刻機 URE—2000/35(中國科學院光電科技研究所)；等離子處理儀 DT—01型(蘇州奧米格機電科技有限公司)；細胞培養箱 BB15型(Heraeus)；光纖光柵解調儀(上海漢坤光電科技有限公司)；往復伸縮機 DIY—37GB330型(東莞市秦藝電機有限公司)；酶標儀 MULTISKAN MK3型(ThermoFisher Scientific)；倒置熒光顯微鏡 DMi8型(Leica)；掃描電子顯微鏡 SU8000型(Hitachi)；倒置相差顯微鏡 CKX41SF型(Olympus)。

1.3 微流控芯片及其基材PDMS膜的制備

芯片制備：通過Auto-CAD軟件設計繪制微通道圖案，打印出掩模版。隨后對SU—8光刻膠進行紫外光刻，制得具有通道圖案的光刻膠陽模。將PDMS預聚物與固化劑按10︰1的質量比進行混合并攪拌均勻，待混合物消泡后澆注到光刻膠模具上，在70 ℃固化成型30 min，得到復刻有微通道圖案的PDMS陰模。對陰模進行打孔(芯片的入口和出口)處理，并將其與PDMS膜片(作為微流控通道的底材)一同等離子處理，封裝后得到微流控芯片。

PDMS膜制備：將上述混合物澆注到平整的培養皿中，同樣條件下固化成型。成型后，將其裁剪為直徑約為20 mm的圓形薄片備用。

1.4 PDMS膜表面與微流控芯片通道內表面的涂覆改性

滅菌：在制備好的芯片通道中注入75 %(體積分數)乙醇，將其與PDMS圓形薄片置于75 %(體積分數)乙醇中浸泡2 h，經磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)清洗后再用紫外照射30 min。

PDMS膜表面的涂覆改性：材料滅菌后置于12孔板中，后分為4組。第一組PDMS膜不做任何處理(對照)，其他組分別加入500 μL粘附因子(AF)、I型膠原(collagen I)和纖連蛋白溶液(fibronectin)，靜置涂覆12 h，吸走溶液，備用。粘附因子溶液購自上海驕榮生物科技有限公司(Gibco)；I型膠原溶液通過0.006 mol/mL的乙酸配制，濃度為0.012 g/L；纖連蛋白溶液由無菌超純水配制，濃度為25 mg/L。

微流控芯片通道內表面的涂覆改性：用注射器吸取活性物質溶液并注入微通道中，靜置涂覆12 h，吸走溶液，備用。

1.5 細胞的接種與培養

本文選用大鼠骨髓間充質干細胞(P3—P5)，使用含10 %FBS的α-MEM低糖培養基在37 ℃、5 % CO2的培養箱中培養。接種前，細胞(約長滿培養瓶底部80 %)經胰蛋白酶消化得到細胞懸浮液，離心去除消化液，后對細胞進行重懸并計數。

PDMS膜上接種：將細胞懸浮液稀釋到105個/mL。吸取等量細胞懸浮液加到置于12孔板底部的PDMS膜上(經不同活性物質預涂覆處理)，每孔500 μL，再補加1 mL新鮮培養液。置于培養箱中孵育2 h后將孔板中的細胞懸液吸棄，再加入新鮮的生長培養液，放入37 ℃、5 % CO2的細胞培養箱中培養。

芯片內接種：將細胞懸浮液稀釋到8×105個/mL。用注射器吸取細胞懸浮液注入到芯片通道內(約30 μL/芯片)進行接種，后置于培養箱(37 ℃,5 % CO2)中孵育1天后，通過注射泵注入新鮮培養液。再分別用5,20,60,100 μL/min的流速加以灌流培養，每天灌流6 h，共3天。

1.6 可傳感復合力學刺激細胞反應器的搭建

按1.3節中的比例配制PDMS預聚物和固化劑的混合物，并澆注到放有壓力傳感器(光纖光柵傳感器)的光刻膠陽模上固化成型。然后參照1.3節進行芯片封裝，便可得到預植有壓力傳感器的微流控芯片。隨后利用優選活性物質纖連蛋白對微通道內表面進行涂覆修飾，實驗步驟參考1.4節中內容。

在可傳感微流控芯片構建的基礎上，結合可控注射泵、往復伸縮機組裝流體剪切力—壓力復合力學刺激系統。流體剪切力是通過注射泵推進裝有培養液的注射器來實現的，通道入口通過導管連接在注射器上，出口由導管接出到收集器以收集排出的培養液。往復伸縮機固定于架子上并置于培養箱上層，標準重物(如砝碼)懸掛在伸縮桿末端，可借助往復機的伸縮實現與微流控芯片頂部的接觸和分離，進而利用往復機的可控運轉來實現對細胞培養體系施加周期性壓力刺激的目的。內置的壓力傳感器結合光纖光柵解調儀，最終實現微流控通道內的實際壓力刺激信號的實時傳感和讀出。

1.7 分析測試

1.7.1 微流控芯片通道截面形貌表征

對封裝后的芯片進行切割，并對對應截面進行噴金處理(10 mA，噴金50 s)，隨后使用掃描電子顯微鏡(SEM)在5 kV電壓下進行觀察并拍攝。

1.7.2 細胞黏附與活力表征

用4 %多聚甲醛固定細胞15 min。然后用DAPI(4 mg/L，染色5 min)和TRITC標記的鬼筆環肽(1 mg/L，染色30 min)分別對細胞核和細胞骨架(F-actin)進行染色。染色完成后，細胞核發藍色熒光，細胞骨架發紅色熒光。隨后用倒置熒光顯微鏡拍攝相關熒光顯微照片。

細胞活力通過CCK—8試劑盒進行表征。用CCK—8混合染色液(培養基：胎牛血清：CCK—8試劑=8︰1︰1)處理細胞2.5 h(置于培養箱中孵育)。孵育結束后，吸取染色液到96孔板中，后置于酶標儀上進行吸光度的測定。

使用倒置相差顯微鏡直接對在微流控芯片通道中灌流培養3天后的細胞進行拍攝記錄，以初步評估灌流培養(施加不同剪切力刺激)后的細胞黏附狀態。

1.7.3 微流控芯片通道內壓力刺激的可傳感性能表征

以往復伸縮機加載標準重物50 g砝碼為例，通過改變往復伸縮機的頻率來評估傳感模塊對微通道內壓力信號的實時傳感性能。當往復機不斷推拉砝碼上下運動時，芯片微通道內的光纖光柵傳感器在壓力作用下產生形變，光纖內耦合波長發生移動(Δλ)，經光纖光柵解調儀解調并由內置軟件計算后便可傳輸出微通道內對應的壓力變化。

2 結果與討論

2.1 PDMS表面改性對細胞黏附和活力的影響

最為常用的微流控芯片構建材料為PDMS。然而，純PDMS材料的細胞黏附性能相對較差(如圖1(a)所示)，難以直接構建適宜于細胞培養的復合力學刺激反應器。為此，本文首先探索了PDMS的表面改性處理方案，具體選擇了三種可促進細胞黏附的活性物質(粘附因子、I型膠原、纖連蛋白)加以涂覆處理。研究結果表明：與不改性的PDMS相比較，纖連蛋白的涂覆改性可非常有效地促進細胞黏附(圖1(a))并提升細胞活力(圖1(b))；I型膠原的改性作用與纖連蛋白比較相去甚遠(圖1)；粘附因子的涂覆改性并未明顯改善細胞的黏附狀況和細胞活力(圖1)。綜上可知，纖連蛋白為優選的活性物質，因而在后續的芯片微通道內表面的修飾中，將直接利用纖連蛋白進行改性處理。

圖1 細胞在不同活性物質改性處理后PDMS基材表面培養1天后的黏附生長情況

2.2 微流控芯片構建與細胞在改性微流控通道內的灌流培養

本文制備的微流控芯片實物照片如圖2(b)所示。芯片含部分彎曲通道，可一定程度上增加細胞的黏附培養面積。芯片通道的預設高度為200 μm，寬度為2 mm，由通道截面SEM圖可以看出，PDMS材料較為準確地復刻了光刻膠模具的通道圖案，且隨機選取的通道入口、中段和出口處的微通道參數(寬度、高度等)較為均一，進一步證實本文作者利用PDMS材料成功制備獲得了預設參數的微流控芯片。

圖2 微流控芯片的設計與實物效果

由于純PDMS材料表面的細胞黏附與鋪展較差(圖1(a))，而較差的細胞黏附與鋪展將會嚴重抑制細胞的生長和增殖[22,23]，因而未經修飾處理的微流控芯片難以直接勝任動態細胞灌流培養等的考察。基于2.1節中的改性探索結果，此處直接利用纖連蛋白對芯片微通道內表面改性處理，隨后分組進行灌流培養考察，嘗試的灌流速度包括：0 μL/min(靜態培養)，5，20，60，100 μL/min。灌流培養3天后，典型組別的細胞黏附相差圖如圖3所示，在60 μL/min流速下，細胞仍然能很好地黏附在通道表面，生長狀態良好，與靜態培養組相比無明顯差異。5 μL/min和20 μL/min流速下的細胞黏附生長情況與60 μL/min類似。然而，當灌流速度提升至100 μL/min后，微通道內的細胞鋪展面積明顯縮小，鋪展形態異常且細胞數量亦明顯減少，這很可能是由于灌流速度過大不利于細胞的黏附生長甚至將部分細胞直接沖出微流控通道所致。綜上所述，PDMS芯片通道內表面經纖連蛋白改性后可明顯提升細胞在通道內表面的黏附能力，這一改性策略成功將本體系可考察的灌流速度上限提升至60 μL/min以上。細胞在微流控通道內的牢固黏附為后續成功搭建復合力學刺激細胞反應器奠定了堅實的技術基礎。

圖3 細胞在纖連蛋白涂覆改性微流控通道內灌流培養3天后的相差顯微照片

2.3 可傳感復合力學刺激細胞反應器的搭建及微流控通道內壓力信號的可傳感性評估

可傳感復合力學刺激細胞反應器示意圖如圖4。

圖4 基于微流控芯片構建的可傳感復合力學刺激細胞反應器示意

其中，剪切力的大小可通過改變注射泵的推進速率準確調控。微通道內流體剪切力的實際大小可通過如下公式[24]推算

式中μ為灌流液體粘度(細胞培養液粘度約為0.001 Pa·s);Q為灌流液體流速,m3/s;b為通道寬度,m;h為通道高度,m。由此計算可知，本研究所制備的微流控芯片中，60 μL/min灌流速度對應的流體剪切力為0.075 Pa，即0.75 dyn/cm2。

標準重物在微流控芯片頂部的加載可對微通道內的細胞施加壓力刺激，壓力的大小可通過改變標準重物(如砝碼)的質量來調整，壓力的施加頻率可通過調整往復機的伸縮頻率加以調控。此外，通過在微通道中植入壓力傳感器還可實時傳感培養通道中的實際壓力信號，結合光纖光柵解調儀的調制及內置軟件的計算，輸出所測得的壓力。光纖光柵解調儀內置軟件對壓力的計算方式如下

式中 Δλ為波長變化，pm；E為PDMS的彈性模量(1 500 kPa)；k為微應變系數(1.2 pm/10-6)，由此計算獲得的壓力單位為Pa。

本研究開發制備的復合力學刺激細胞反應器實物如圖5所示，該反應器簡易小巧，容易放置于細胞培養箱中，非常適于研究流體剪切力—壓力復合刺激對細胞或微組織行為的影響。

圖5 基于微流控芯片構建的可進行復合力學刺激并實時傳感壓力信號的細胞反應器實物照片

為了驗證該反應器對微通道內壓力的可傳感性，采取加載標準重物50 g砝碼為例，通過改變往復伸縮機的頻率來評估傳感模塊對微通道內壓力信號的實時傳感性能。往復機先以0.3 Hz的頻率周期性施加壓力，隨后將頻率提升至1 Hz，如圖6(a)所示。在2.5 s時，砝碼下壓到微流控芯片頂部并維持3 s，此時，微通道內傳感器實際測得的壓力也相應增加，從0 Pa增大到約35 Pa并持續3 s(圖6(b))。5.5 s時，往復機上拉撤去芯片頂部加載的砝碼，微通道內部傳感器實測的壓力也相應撤銷，變為0 Pa。當重復施加壓力或改變施加頻率時，微通道內傳感器實測的壓力值也會發生相應改變，且步調和趨勢與理論的加載信號高度匹配，如圖6所示。由此可見，整合于本反應器中的壓力傳感系統可及時有效地感知并輸出微通道內的實際壓力信號。

圖6 微流控芯片頂部對應的理論刺激信號與通道內實時傳感信號的對比

3 結 論

纖連蛋白對微流控芯片PDMS基材的涂覆改性有效提升了細胞在微流控通道內的黏附和細胞活力，同時將可考察的灌流速度上限提升至60 μL/min以上。此外，通過結合可控的灌流設備和往復伸縮機，本文構建了一種簡易小巧的復合力學刺激細胞反應器，可置于培養箱中用于考察流體剪切力—壓力復合力學刺激對細胞行為的影響，并實時傳感微通道內的實際壓力信號。此反應器在復合力學刺激對細胞或微組織行為影響的研究領域具有潛在應用價值。